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                        TRIeasy^TMTotal RNA Extraction Reagent

TRIeasy^TM总RNA提取试剂（同Trizol）

产品信息                                 

产品描述

TRIeasy^TMTotal RNA ExtractionReagent是一种用于各种动植物、细菌组织/细胞总RNA抽提的试剂，具有极强的裂解能力，可在短时间内裂解细胞和组织样本，保持样品中RNA的完整性，有效抑制RNA的降解。样品在该试剂中能够充分被裂解，在加入氯仿离心后，溶液会形成上清层、中间层和有机层 (鲜红色下层)，RNA分布在上层水相中，收集上清层后，经异丙醇沉淀便可回收得到Total RNA。提取的总RNA纯度高，基本不含蛋白质及基因组DNA，可直接用于Northern、点杂交、mRNA纯化、体外翻译、RT-PCR、poly(A)+选择、RNA酶保护分析以及构建cDNA文库等多种分子生物学实验。

此外，在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。

本品操作简单快速，所有操作可以在一小时内完成。且对少量的组织(50-100mg)和细胞(5×10⁶)以及大量的组织(≥1g)和细胞(>10⁷)均有较好的裂解效果。

运输与保存方法

冰袋（wet ice）运输。产品在4oC避光保存。

注意事项

1)        需自备氯仿、异丙醇（新开封或提取RNA专用）、75%乙醇 (DEPC水配制)、DEPC和DEPC水。

2)        戴一次性干净手套；在单独的洁净的区域操作；在操作过程中避免讲话，以防实验者汗液、唾液中的RNase的污染。

3)        请尽量使用RNase free的实验器具，包括枪头和离心管。耐高温器物可150℃烘烤4小时以去除RNA酶，其它器物去除RNA酶可考虑用0.1%的DEPC水浸泡过夜，然后灭菌，烘干。溶液需用DEPC水配制。RNA实验用的器具和试剂应专门使用，不要用于其它实验。DEPC水建议分装后保存。

4)        本产品中含有苯酚，具有毒性和腐蚀性。如果吸入体内、接触皮肤、吞食等会中毒、导致灼伤以及其他身体伤害。使用本产品时应穿戴防护物品，如防护服装、手套、眼罩、面罩等。如果不小心接触到眼睛时，应立即用大量的水冲洗以及前往医院治疗；

5)        样品用TotalRNA Extraction Reagent匀浆后，如果不即刻加入氯仿进行下游实验，可先于-70℃下冻存，可保存一个月以上。另保存在75%乙醇中的RNA沉淀，可于4℃保存1周，-20℃保存1年。

6)        RNA半衰期比较短，易降解，建议抽提后尽快进行后续实验。

参考用量

表1  每1 ml Total RNA Extraction Reagent能够充分裂解的最大样本量如下：

*过多的样本量可能会导致裂解不充分，并使产物纯度降低。

操作流程

1        样品的处理

1.1 样品的匀浆

A．贴壁细胞

尽量弃去培养液，直接往直径87.5px的培养板中加入1ml Total RNA Extraction Reagent覆盖并反复吹打裂解细胞。

注：1）依据培养板的面积而不是细胞的数量来决定所需的Total RNA Extraction Reagent 量（每250px²加1ml）。

2）当加入Total RNA Extraction Reagent量不足时可导致抽提的RNA有DNA污染。

3）贴壁培养细胞往往不能完全从培养瓶（皿）脱落，这并不意味着裂解不完全，此时细胞膜实际已经完全裂开，并已释放RNA，继续后续实验即可。

B．悬浮细胞

离心收集细胞，每5 × 10⁶-1 ×10⁷个细胞加入1 ml Total RNA Extraction Reagent，用移液器反复吹打直至无明显颗粒样存在。

注：在加入TotalRNA Extraction Reagent前避免洗涤细胞，否则会增加mRNA降解的可能性。裂解某些酵母和细菌可能需要使用匀浆器。

C．动/植物组织

取新鲜动植物组织或-70℃冻存动物组织在液氮中充分研磨，按照表1加入适当量Total RNA Extraction Reagent混匀。或取新鲜动植物组织尽量剪碎，加入适当Total RNA Extraction Reagent量，匀浆仪进行匀浆处理。

注：样品体积一般不要超过Total RNA Extraction Reagent体积的10%。

1.2    将匀浆样品剧烈震荡后在室温条件下放置5分钟以使核蛋白体完全解离。

1.3    （可选）在4℃条件下，12000rpm 离心10min，取上清。

注：如样品中含有较多蛋白质、脂肪、多糖或肌肉，植物的块茎结节等可离心去除。离心后的沉淀中包含有细胞外膜、多糖以及高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂应尽量去除，取澄清的匀浆液进行后续实验。

2 总RNA提取

2.1向上述裂解液中加入1/5体积的氯仿。盖紧离心管盖，剧烈震荡15秒，室温静置2-3min。

2.2 12,000 rpm 4°C 离心10-15分钟。

注：1）离心后混合物可分3层：上层无色水样层，中间层，下层红色有机苯酚氯仿层。RNA无一例外的存在于水样层中。

2）该部分容量大约为所加Total RNA Extraction Reagent总量的50-60%。如用1 ml Total RNA Extraction Reagent提取，上层水相约为500-600 μl。建议吸取400-500 μl，不要吸的太完全，以防吸到中间层导致基因组污染。

3）有机相和中间层是蛋白和DNA，如有需要，请予以保留，并进行相关纯化实验。

2.3 小心吸取上层水相至一个新的离心管中，加入等体积的异丙醇。颠倒混匀后室温放置10min。（RNA沉淀在离心前通常不可见，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。）

2.4  12,000rpm室温或4°C 离心10分钟。

2.5小心弃去上清，加入1 ml用DEPC水配制的75%乙醇。充分洗涤管盖和管壁，并轻弹管底，让沉淀悬浮起来。每使用1ml Total RNA Extraction Reagent用1ml 75%乙醇对沉淀进行洗涤。

2.6  12,000 rpm室温或4°C 离心3分钟，弃去上清，注意不要丢失RNA沉淀。

注：剩余的少量液体可短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀。

2.7 室温放置2-3min，晾干。加入30-100ulRNase freewater（DEPC水），待完全溶解后，取少量检测，其余在-70°C保存。

3 产物检测

A. 完整性检测

1）取1μl RNA加入适当10 × DNA loading buffer，混匀。

2）进行1%琼脂糖凝胶电泳。若能看见清晰的三条带，证明RNA完整性较好。

注意：如果是普通的琼脂糖凝胶电泳，28S的位置大约在2kb，18S大约在1kb的位置，不同浓度的凝胶位置变化较大。

B. 纯度检测

检测260 nm，280 nm OD值，并计算OD 260/OD 280。纯的RNA的比值应在1.8-2.2之间。