来宝网 2015/4/29点击1317次
HieffTM First Strand cDNA Synthesis Kit
HieffTM第一条链 cDNA合成试剂盒
产品信息
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产品名称 |
产品编号 |
规格 |
储存 |
价格（元） |
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HieffTM First Strand cDNA Synthesis Kit HieffTM第一条链 cDNA合成试剂盒 |
11102ES50 |
50T |
-20 oC |
510.00 |
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11102ES72 |
5×50T |
-20 oC |
2295.00 |
产品描述
HieffTM First Strand cDNA Synthesis Kit基于HieffTM Reverse Transcriptase，该酶热稳定性提高，在50℃的半衰期超过240min，且可长时间耐受高达55℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录，能稳定可靠地合成cDNA。且HieffTM ReverseTranscriptase的独特设计，进一步增强了模板亲和力和行进性，使得全长cDNA的合成能力有了大幅度提升，可获得长达20 kb的cDNA，并且对于常见的逆转录抑制物具有更高的耐受度，非常适合于植物组织RNA的逆转录反应。
本试剂盒包含由总RNA或mRNA合成高质量第一条链cDNA所需的所有成分，并提供两种cDNA合成引物：Random hexamers和oligo（dT）18。合成的单链cDNA产物可直接用来进行后续PCR、qPCR以及PCR克隆。其中，5 × RT Mix包含优化的缓冲体系和dNTP； HieffTMEnzyme Mix包含HieffTM Reverse Transcriptase和RNase inhibitor。可根据需要，选择Oligo(dT)18、Random hexamers或基因特异引物作为逆转录引物。
产品组分
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组分编号 |
组分名称 |
产品编号/规格 |
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11102ES50（50T） |
11102ES72（5×50T） |
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RNase free ddH2O |
1 ml |
5×1 ml |
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11102-B |
5×RT Mix |
200 μl |
5×200 μl |
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11102-C |
HieffTM Enzyme Mix* |
50 μl |
5×50 μl |
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11102-D |
Oligo dT18 (0.5 μg/μl) |
50 μl |
5×50 μl |
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11102-E |
Random hexamers (N6) |
50 μl |
5×50 μl |
* 包含RNase inhibitor，用于抵抗环境和体系中可能存在的痕量的RNase。
运输与保存方法
冰袋（wet ice）运输。产品在-20 oC保存。有效期1年。
质量控制
所有组分经检测均无核酸外切酶、核酸内切酶、RNase残留。
功能检测1：以500 ng mouse total RNA为模板，Oligo dT18为引物，50℃反应45分钟。取1/10cDNA产物进行PCR扩增nebulin基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的20.0 kb条带。
功能检测2：以100 pg Hela cell total RNA为模板，Oligo dT18为引物，50℃反应30分钟。取1/10 cDNA产物进行PCR扩增β-actin基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的550bp条带。
功能检测3：以500 ng Hela cell total RNA为模板，Oligo dT18为引物，55℃反应45分钟。取1/10 cDNA产物进行PCR扩增Polε基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的4.8kb (GC-rich)条带。
功能检测4：以1 pg-1 μg HeLa cell total RNA为模板，以Oligo dT18和Randomhexamers为引物，测试qRT-PCR性能。
以6个数量级的模板量的对数值对Ct值做标准曲线，R2>0.990，斜率在-3.20到-3.60之间。
客户需要准备的材料
? RNasefree的1.5 ml微量离心管或0.2mlPCR管
? 水浴锅或PCR仪
? 冰
? RNA（高质量的完整的RNA对于获得高质量的cDNA是至关重要的。
引物选择
1） 如果模板为真核生物来源，建议选择Oligo dT18，其与真核生物mRNA的3’Poly A尾配对，可获得最高产量的全长cDNA。
2） 基因特异性引物 (GSP)的特异性最高。但有些情况下，用于PCR反应的GSP无法有效引导第一链cDNA合成。这时，可改用Oligo dT18或Random hexamers重新进行逆转录。
3） Randomhexamers特异性最低，所有RNA，包括mRNA、rRNA、tRNA均可以作为Randomhexamers的模板。当目标区域具有复杂二级结构或GC含量较高，或者模板为原核生物来源，使用Oligo dT18或基因特异性引物 (GSP)无法有效引导cDNA合成时，可使用Random hexamers为引物。
应用实例
1 第一条链cDNA合成*（以20μl反应体系为例）
1）按照下表在RNase free离心管中配制如下混合液：
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RNase free ddH2O |
to 20 μl |
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Oligo(dT)18(0.5 μg /μl) or Random Primer or Gene Speicific Primers |
1 μl |
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or 1 μl |
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or 2 pmol |
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5× RT Reaction Mix |
4 μl |
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HieffTM Enzyme Mix** |
0.8-1μl |
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模板RNA |
Total RNA: 50 ng-5 μg/mRNA: 5-500 ng |
*可选步骤（一般不需要）：如果RNA模板GC含量丰富或者有复杂二级结构，可以先只加RNA模板、引物和和RNase freeH2O混匀，65℃变性5分钟，冰上冷却 5min，短暂离心后加入其它成分继续下面的反转录步骤。
** HieffTM EnzymeMix非常粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸头外导致损失，用前请瞬时离心后使用，并且避免吸头外壁沾附损失。可每次按照0.8μl使用，不会影响使用效果。
2）用移液枪轻轻吹打混匀。
3）如用Oligo(dT)18或基因特异引物(GSP)，42℃孵育30-50min。
如用RandomPrimer，25℃孵育10 min，42℃孵育30-50 min。
4）65℃加热15 min(或者85℃加热5 min)失活HieffTM Reverse Transcriptase。
2 RT-PCR
建议取1/10-1/5 体积(2-4 μl)的反转录产物作为PCR模板。
1）建议反应条件
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Components |
Volume |
Final Concentration |
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cDNA Template |
2 μl |
as required |
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Forward Primer (10 μM) |
1 μl |
0.2 μM each |
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Reverse Primer (10 μM) |
1 μl |
0.2 μM each |
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10×Taq Buffer (含Mg2+) |
5 μl |
1× |
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2.5 mM dNTPs |
4 μl |
0.2 mM |
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Taq DNA Polymerase |
0.5 μl |
2.5 units |
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ddH2O to final volume |
50 μl |
Not applicable |
2）建议反应程序
94℃ 2-5 min
94℃ 30 sec
50-60℃ 30 sec 30-40 cycles
72℃ 1-2 kb/min
72℃5-10 min
2.2 后续qPCR
注意事项
1) 所有操作均应在冰上进行。
2) 除使用RNase free的枪头和离心管外，RNA实验用的试剂建议专用，并在单独的洁净的区域操作。操作时，戴上口罩和一次性手套，避免说话。总RNA提取完成后，建议取少量跑1%琼脂糖凝胶电泳，检验RNA的完整性。
3) 逆转录反应抑制物包括酚，盐，SDS，EDTA等。建议用75%乙醇 (用DEPC水配制)仔细洗涤RNA沉淀 (轻弹管底让沉淀悬浮，并静置数分钟)。
4) 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
