来宝网移动站

1.HDL-C检测方法

1.1概述
   
    测定血清HDL-C通常需根据各种脂蛋白的密度、颗粒大小、电荷等应用超速离心法、色谱法、电泳法、化学或免疫沉淀法将HDL与其他脂蛋白分离开,测定HDL组分中胆固醇(Chol)含量。美国疾病控制与预防中心(CDC)测定HDL-C的参考方法为超速离心法,也为NCEP所推荐。此法主要用于靶值的确定及各种HDId-C检测方法学评价,但因需特殊仪器,对技术操作要求高,一般实验室难以开展。CDC胆固醇参考方法实验室网络(CRMLN)近来选用了一种"指定性比较方法"(DCM法)作为转移CDC参考方法准确性的适用方法-硫酸葡聚糖- 镁(DS50-Mg2＋)沉淀结合ALBK法。这种方法相对CDC参考方法而言，已大为简化。色谱法和电泳法因仪器、操作要求高等种种原因临床常规实验室也较少应用,多用于脂蛋白的研究。

    目前临床常规实验室直接分离测定HDL-C的方法大致可分为3代。第1代为化学沉淀法,常用的沉淀剂为多阴离子,如磷钨酸(FTA)、DS、肝素(Hep)或非离子多聚体如聚乙二醇（PEG）与某些两价阳离子(如Mg2＋、Ca2＋、Mn2＋)合用。最早为美国国立卫生研究院(NIH)所采用的肝素-锰沉淀法(HM法),后多采用DS50-Mg2＋矿法,欧洲则多采用磷钨酸镁沉淀法(PTA-Mg2＋法)和聚乙二醇沉淀法(PEG法)。1995年中华医学会检验分会曾在国内推荐PTA-Mg2＋法作为HDL-c测定的常规方法。但此类方法常因含apoB的脂蛋白组份沉淀不完全导致结果假性偏高。第2代采用简便的磁珠DS-Mg2+分离法(美国Reference Diagnostics公司试剂),省去了离心步骤,但需特殊装置,该剂不适于推广应用。第3代为匀相测定法,轩d本用量少,不需沉淀处理,可用于自动生化分析仪测定,在准确度和精密度方面基本达到NCEP的分析目标,因此在短短的数年里迅速被临床实验室采用。

1.2匀相测定法

1.2.1选择性抑制法(Polyanion Polymer/detergent HDL-C assay,PPD法)应用两种不同的表面活性剂及多聚阴离子,根据脂蛋白的酶反应选择性,直接测定HDL-C。试剂I中含多聚阴离子和分散型表面活性剂(亦称反应抑制剂),CM、VLDL、LDL在多聚阴离子环境下发生凝聚；由于反应抑制剂与CM、VLDL、LDL的疏水性基团具有高度亲和力,故其附在凝聚的脂蛋白颗粒表面形成遮蔽圈,抑制其表面的游离Chol反应。同时在游离的HDL表面也吸附有少量反应抑制剂,但由于亲和力较弱,其结合是可逆的。试剂Ⅱ中有对HDL颗粒中亲水性基团具高亲和力的可溶性表面活性剂(亦称反应促进剂),其对HDL表面的吸附不仅置换出第一反应中HDL表面吸附的反应抑制剂,而且使HDL形成可溶性复合休,从而使HDL-C可直接与酶试剂(含胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶等)发生反应。该方法的主要代表试剂盒为日本第一化学药品株式会社(Daiichi pure Chemicals Co.) Cholestest HDL和美国Genzyme Diagnostics公司的N-genousTMHDL-C试剂盒。

1.2.2  PEG修饰酶法(PEG-modified enzvme HDL-C assay,PEGME法)在Mg2+的存在下,α-环糊精硫酸盐与CM、VLDL、LDL形成可溶性复合物。这些复合物能抵抗变构酶的作用；PEG 6000或葡聚糖右旋糖苷与胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶共价结合,引起酶的变构,变构酶对脂蛋白的大小和/或电荷具有选择性,其顺序依次为LDL<VLDL≈CM<HDL。而α-环糊精硫酸盐能限制CM、VLDL颗粒进入环状的环糊状结构,从而避免酶的催化作用,这种作用还与Mg2+的浓度有关。因此在Mg2+及少量DS存在的前提下,可直接测定HDL-C。主要代表性试剂盒有日本协和(kyowaMedex Co.)、罗氏诊断(Roche Diagnostics)和德国(Centronic GmbH)公司的产品。

1.2.3  清除法(Clearance method)

1.2.3.1  反应促进剂-过氧化物酶清除法(Synthetic polymer/detergent HDL-C assay ,SPD法)

    其原理为利用脂蛋白与表面活性剂的亲和性差异。加人试剂I,在反应促进剂(合成的多聚物/表面活性剂)的作用下,血清中CM、VLDL及LDL形成可溶性复合物,它们表层的游离胆固醇(FC)在胆固醇氧化酶的催化下发生反应生成H202,在过氧化物酶的作用下,H202被清除。加入试剂Ⅱ,在一种特殊的选择性表面活性剂作用下,只有HDL颗粒成为可溶,所释放的Chol与胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶反应,生成H202,并作用于4AAP色原体产生颜色反应。代表试剂盒是日本第一化学药品株式会社新近推出的Cholestest N HDL试剂盒。

1.2.3.2  过氧化氢酶清除法(Catalase HDL-Cassay,CAT法)其原理为试剂I中具有特异选择性的强离子缓冲液与表面活性剂作用于血清中CM、VLDL及LDL,使其所含的Chol暴露,在胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的催化反应下生成H202,H202被过氧化氢酶(catalase)分解为H2O和O2而被清除。试剂Ⅱ中的叠氮纳抑制了过氧化氢酶活性,另一表面活性剂使HDL颗粒中的Chol暴露,并与胆固醇酶试剂发生反应,用标准的Trinder反应即可测定HDL-C。应用两点速率法可减少高胆红素和高TG对测定结果的影响。代表试剂盒是日本生研(Denka ceiken Co.)和英国朗道(Randox Laboratodies Limited)公司试剂盒。

1.2.4免疫分离法(Immunoseparation method,IS法)

1.2.4. PEG/抗体包裹法(International Reagents Corp HDLC assay,IRC法)为最早期由日本国际试药公司(International Reagents Co.)研制的试剂盒(测定过程包括4种试剂)。原理是先用低浓度的PEG4000包裹CM、VLDL,LDL,加入特异性抗apoB、apoCⅢ抗体,使CM、VLDL和LDL颗粒复合物凝聚,然后加入胆固醇酶试剂,用于检测上述复合物以外脂蛋白胆固醇(即HDL-C),最后加入盐酸胍试剂,终止酶促反应和溶解含apoB脂蛋白复合物,以免其干扰吸光度测定。

1.2.4.2抗体免疫分离法(antibody immunoseparation HDL-C assay,AB法)由日本和光制药公司(Wako pure Chemicals Industry)新推出的试剂。其原理与上述方法相似。试剂I中的抗人    β脂蛋白抗体首先与血清中的CM、VLDL、LDL结合形成抗原-抗休复合物;加入试剂Ⅱ后,抗原-抗体复合物不与酶试剂起反应, 生成H202,并通过Trinder指示反应测定HDL－C含量。

2  LDL-C的测定方法

2．1 概述  测定血清LDL-C通常需根据各种脂蛋白密度、颗粒大小、电荷或apoB含量等,应用超速离心法、色谱法、电泳法、化学或免疫沉淀法将LDL与其他脂蛋白分离开,然后测定LDL组分中Chol含量。

    目前尚没有真正意义的测定LDL－C的参考方法。CDC测定LDL-C暂定的参考方法为超速离心法(Betaquantification,β-定量法/BQ法),也为NCEP所推荐。方法基本同HDL-C测定。此法测定的LDL－C,实际上包括脂蛋白(a)[Lp(a)]和中间密度脂蛋白(IDL)的胆固醇含量,也是评价其他检测方法准确性的基础。此法需昂贵的设备、操作复杂、费时且技术要求高,不易在普通实验室开展。Friedewald公式计算法是目前应用较广的估测LDL-C的方法,被NCEP推荐为常规测定方法。其以VLDL组成恒定(VLDL－C/TG＝0.2,均以mg/dl计)的假设为前提,具有简便、直接、快速等优点。应用此公式计算山LDL-C常受TC、TG和HDL-C变异的影响,总变异可达9.5%。但在血清中存在CM、血清TG〉4.52mmol/L(400mg/dl)、血清中存在异常β脂蛋白时[Ⅲ型高脂血症(HLP)]时不宜采用Friedewald公式法计算。色谱法和电泳法因仪器、操作要求高等种种原因临床常规实验室也较少应用,多用于脂蛋白的研究。

    目前临床常规实验室直接分离测定LDL-C的方法法大致可分为3代。第1代为化学沉淀法,常用方法为肝素-枸橼酸纳法、聚乙烯硫酸沉淀法(PVS法)和多环表面活化阴离子法等。因PVS法为非离子反应,实验条件要求不高,在pH3-8范围内均可完全沉淀且PVS不干扰酶法测定Chol,1995年中华医学会检验学会在国内推荐此法作为LDL-C测定的常规方法。这类方法主要缺点是TG水平较高(>4.52mmol/L)时,有时因LDL沉淀不完全而使结果偏低。第2代方法有两类:一类为免疫分离法(Immunoseparation Method),美国Genzyme Diagnostics和 Sigma Diagnostics公司已有可供临床应用的直接测定LDL-C商品试剂盒。即用PEG和结合有羊抗人apoE、apoAI多克隆抗体的胶乳珠分离试剂除去HDL(含apoAI/E)、IDL(含apoE)、VLDL(含apoE)及CM(含apoAI/E),直接进行LDL-C测定水平。此法精密度好,准确度高,特别是对于低LDL-C浓度的测定结果准确。

    与β-定量法有较好相关性,不受高TG水平的影响,可用于禁食或非禁食标本的检测。缺点是需专用分离管,试剂成本较高,难以自动化,且不适于冰冻或冻干标本的测定。可用于TG〉4.52mmol/L的少数患者LDL-C的检测,对于极少的Ⅲ型HLP患者LDL-C的测定亦有一定应用价值。另一类为简便的磁珠肝素分离法(美国Reference Diagnostics公司试剂),此方法不需离心,操作简便,精密度高,与Friedewald公式法相关性好,与β-定量法结果一致。但此法所需标本量大,需特殊装置,特异性稍差,实验室较少应用此试剂盒。第3代为匀相测定法,标本用量少,不需沉淀处理,可用于自动生化分析仪测定,在准确度和精密度方面都可达到NCEP的分析目标。

2.2  匀相测定法

2.2.l  透射比浊法  罗氏诊断(原Boehringer Mannheim)公司基于多聚阴离子试剂PAMPS与LDL颗粒发生特殊凝集反应设计而成的早期试剂。试剂1中的两性离子表面活性剂可使样品中HDL、CM和VLDL(富含TG)颗粒遮蔽。加试剂2[含触须状多聚阴离子(PAMPS)和两性离子表面活性剂],在Mg2+存在下,LDL颗粒与PAMPS作用形成LDL-触须状多聚阴离子复合物,所产生浊度与LDL-C含量成比例。此法在某些自动生化分析仪上的应用受到一定限制。目前Roche公司已停止生产此类试剂,改用可溶性反应法。

2.2.2清除法(Clearance method)

2.2.2.1表面活性剂清除法(surfactant LDL-C assay,SUR)日本第一化学药品株式会社(Daiichi)的Cholestest LDL、Genzyme Diagnostics公司的N-genousTMLDL-C试剂盒均属此类方法,是国内外目前使用最广泛的一类试剂。试剂1中的表面活性剂能改变LDL以外的脂蛋白(HDL、CM和VLDL等)结构并解离,所释放出来的微粒化Chol分子与胆固醇酶试剂反应,产生的H2O2在缺乏偶联剂时被消耗而不显色,此时LDL颗粒仍是完整的。加试剂2(含表面活性剂2和偶联剂DSBmT),它可使LDL颗粒解离释放Chol,参与Trinder反应而显色,因其他脂蛋白的Chol分子已除去,色泽深浅与LDL-C量呈比例。

2.2.2.2过氧化氢酶清除法(Catalase LDL-C assay,CAT法)以日本Ddenk Seiken公司、英国RANDOX公司和美国Polymedco公司试剂盒为代表。其原理为:第一步反应中,具有特异选择性的强离子缓冲液与表面活性剂作用于血清中CM、VLDL、HDL,所释放出的Chol在胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的催化反应下生成H2O2,H2O2被过氧化氢酶分解为H2O和O2。第二步,在另一表面活性剂的作用下,LDL颗粒中的Chol被释放出来,并与胆固醇酶试剂反应,用标准Trinder反应即可测定LDL-C。其试剂2中所含叠氮钠可抑制第二步反应中过氧化氢酶活性。此法在第一步反应中可除去非VLDL颗粒的潜在干扰,试剂中特有的表面活性剂可减少高胆红素和高TG时对测定结果的影响。

2.2.3杯芳烃法(Calixarene LDL-C assav,CAL法)为日本国际试药公司(International ReagentsCo.)新近研制开发的一种检测试剂,尚未在全球市场广泛销售。其原理为:第一步反应中,试剂1中所含的表面活性剂杯芳烃(Calixarene)可将LDL转换成可溶性LDL-杯芳烃复合物,血清中CM、VIDL、HDL颗粒中的Chol在胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶的催化反应下,与肼作用生成胆甾烯酮腙。第二步,试剂2中的脱氧胆酸盐将可溶性LDL-杯芳烃复合物打破,LDL颗粒中的Chol被释放出来,并在β-NAD存在的情况下与胆固醇酯酶、胆固醇脱氢酶反应,生成胆甾烯酮腙和β-NADH,通过测定β-NADH的变化即可测出LDL-C含量。

2.2.4可溶性反应法(Solubilization LDL－C assay,SOL法)此类试剂以日本协和(kyowa Medex)公司和Roche公司为代表。试剂1含α-环糊精硫酸盐、硫酸葡聚糖(DS 500)、MgCl2和MOPS,试剂2中含胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、4-AA、POE-POP和MOPS。α-环糊精硫酸盐在少量DS及Mg2+存在下,可减少CM和VLDL组分中的Chol与酶试剂的反应。多聚物聚氧化乙烯-聚氧化丙烯封闭共聚多醚(POE-POP)可减少HDL组分Chol的反应。两者结合则可选择性地测定LDL-C。

2.2.5保护性试剂法(Protecting reagent LDL-C assay,PRO法)以日本和光(Wako Chemicals)公司和美国Sigma Diagnostics公司试剂为代表。其原理是:第一步试剂1中含CHER、CHOD、过氧化氢酶、多聚阴离子和两性表面活性剂,后者可选择性保护LDL,防止其与胆固醇酶试剂反应。非LDL-C与胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的催化反应生成H202,H202被过氧化氢酶分解为H2O和O2。第二步,在另一非离子表面活性剂的作用下,LDL颗粒中的Chol被释放出来,并与胆固醇酶试剂反应,用标准Trinder反应即可测定LDL-C。

3对匀相测定法的技术要求

3.1对LDL-C测定的要求

  对LDL-C测定而言,同一反应原理会有不同的试剂配方,而且这些配方也在不断地改进,还会不断涌现出新的方法与试剂。采用通过CDC CRMLN验证认可的匀相测定法试剂,使HDL-C 临床测定更加便利、更力准确。常规应用时应按照仪器和试剂盒说明书采用双试剂、双波长测定,根据反应进程曲线确定读数时间。样品与反应总体积之比为1:100-1:150。根据试剂盒要求采取1点或2点定标。

    由于目前尚无HDL-C测定的决定性方法及1o级参考材料,使HDL-C标准化工作难度大。CDC-NHLBI的标准化程序对HDL-C检测的可接受限的目标进行了规定。要求检测准确度在CDC参考值(RV)的±10%以内,在小于1.03mmol/L(4Omg/dl)、1.03-1.55mmol/L(40-60mg/dl)、大于1.55mmol/dl 60mg/dl)浓度范围内,HDL-C检测的最大不精密度s分别为0.065mmol/L(25mg/dl)、0.078mmol/L(3.Omg/dl)、0.09Ommol/L(3.5mg/dl)。NCEP1998年后目标定为为总误差≤13%;精密度要求HDL-C≥1.09mmol/L(42mg/dI)时,CV≤4%；〈1.09mmol/L时,s≤0.044mmol/d1(7mvdl)。准确度要求偏差≤±5%。应用匀相测定试剂时还应注意下述问题:试剂盒配套用校准品应准确定值,采用CDC RM法进行准确性转移；校准物的定值应可溯源到已有的参考系统。特异性要高,高LDL-C,高VLDL-C对测定结果基本无明显影响,回收率为90%~110%。最小检测水平至少为0.01mmol/L,线性上限至少可达2.59mmol/L(100mg/dl)。抗干扰能力应为:TG＜5.65mmol/L也(500mg/dl)、胆红素〈513μmol/L(30mg/dl)、Hb<5g/L时,对测定结果基本无干扰。采用参考方法或CRMIN DCM法进行方法学比较,相关系数r在0.95以上。未开封的试剂盒在2℃-8℃至少稳定6个月,开封后至少可保存1个月。

3.2对LDL-C测定的要求近年来相继报道一些新的匀相测定法检测LDL-C的试剂,并通过CDC CRMIN验证认可,使得LDL-C的临床常规测定更加方便,准确。临床应用时应按照仪器和试剂盒说明书采用双试剂、双波长测定,根据反应进程曲线确定读数时间。样品与反应总体积之比为1:1OO-1:150。根据试剂盒要求采取1点或2点定标。

    目前国内外尚无LDL-C测定的决定性方法与1o级参考材料,NCEP推荐CDC的β定量法为参考方法,2o级参考材料为CDC冰冻血清(NIST SRM 1951a,CAP RM 026)。NCEP暂推荐CDC的β-定量达为参考方法,Friedewald公式法为常规方法。1995年开始我国根据国内实际情况,在广大临床实验室中广泛推广化学沉淀法(如PVS法)直接l测定LDL-C,这样可防止|临床应用中因测定结果不准确而造成的混乱。近年来各种匀相测定法试剂因简便、快速,精密度高,易于自动化而为广大临床实验室所接受。应用匀相测定试剂时还应注意下述问题:试剂盒配套用校准品应准确定值,采用CDC RM法进行准确性转移；校准物的定值应可溯源到已有的参考系统。NCEP对山LDL-C测定的分析目标进行了规定,要求总误差≤12%;不精密度要求CV≤4%,不准确度要求偏差≤4%(与β-定量法测定参考值比较)。与参考方法或CRMLN DCM法进行方法学比较结果应基本-致(相关系数r在0.95以上)。特异性要好,高HDL-C、VLDL-C对测定基本无明显影响,回收率为90%-110%。线性范围要宽,最小检测水平至少为0.Olmmol/L检测上限至少为7.77mmol/L(300mg/dl)。抗干扰能力强:|TG<5.65mmol/L(500mg/dl)胆红素〈513μmol/L(30mg/L)、|血红蛋白〈5g/L时,对测定|结果基本无干扰。未开封的试剂盒在2℃-8℃至少稳定6个月,开封后至少可保存l个月。

摘自：检验医学信息网