摘要 目的： 探讨γ-谷氨酰转移酶(GGT)在肝癌中的表达机制及其定量分析肝癌特异性GGT(HS-GGT)的临床价值。方法：从肝癌组织中纯化总RNA, 以RT-PCR扩增GGT基因并分析M3位点甲基化状态,制备酶蛋白观察不同分子形式GGT的表达与改变,并定量检测了不同肝病患者血清HS-GGT水平。结果：人肝癌至远癌组织中总RNA浓度呈明显升高趋势(P＜0.05),GGT基因检出率分别为100%、85%和75%,而M3位点呈低甲基化状态，其频率分别为75%、55%和50%;癌组织中GGT过度表达,血清HS-GGT活性在肝癌组明显升高,以高于5.5U/L为界诊断肝癌的阳性率为86%,而在其他患者中的阳性率低于3%。结论：基因甲基化状态降低导致GGT异常表达,定量分析HS-GGT有助于肝癌的诊断与鉴别。
3 讨论
肝癌是由病毒、化学致癌物等多病因作用以及经启动、促进、演变多阶段的发病过程。因癌基因或癌相关基因激活、抗癌基因失活或胚胎期某些酶基因重新复活等诸多因素引起肝细胞生长失控,出现持续增殖而致癌变,其中基因状态与调控和表达关系密切［5］。肝细胞癌变过程中能合成和分泌多种与肝癌相关的蛋白质、多肽或同工酶,如AFP和HS-GGT均是肝癌细胞异常表达的产物。人类GGT胚胎期活性甚高，出生后迅速降至低水平,肝细胞癌变时重新表达,并出现对肝癌定性诊断具有特异性的同工酶区带,但为何异常表达的分子生物学机制尚不清楚。本研究以RT-PCR扩增了GGT的基因片段,分析GGCC位点的甲基化状态，定量检测了肝病患者血清HS-GGT浓度,对HS-GGT在诊断和鉴别诊断肝癌上的价值进行了探讨。
GGT基因的5‘-NC区含6个CCGG位点,利用HapⅡ能识别并切断未甲基化CCGG序列,可推测扩增片段中M3位点是否甲基化。以人肝癌细胞株GGT基因的序列引物,成功地扩增了人肝癌组织及癌周组织中的GGT基因片段,扩增后的终产物与原设计完全一致，且区带清晰。20例癌组织GGT基因扩增片段检出率为100%,癌周和远癌组分别为85%和75%。对M3位点的酶切分析，发现在肝癌、癌周和远癌组织中M3位点甲基化程度均低于30%,而呈广泛的低甲基化状态，各组内未甲基化例与甲基化例的差别非常显著,提示GGT表达受基因甲基化程度的调节。癌变过程中GGT基因去甲基化［6］,使已关闭的GGT基因重新活化,再过量表达出GGT引起肝组织和血中酶活性的大幅度升高,在癌组织的不同部分存在着甲基化状态的不均一性。Suzuki等以低甲基化5-杂氮胞嘧啶使鼠5-甲基胞嘧啶含量明显减少［7］,鼠肝GGT呈过量表达以及鼠肝癌出现,而对照鼠未见异常,说明GGT基因去甲基化与肝癌发生有关［8］。
鼠肝癌模型的研究发现,癌变组织GGT表达接近胎肝的GGT水平,肝癌组织GGT基因所编译的肽链与胎肝GGT酶蛋白相一致,且组织GGT以可溶性GGT和膜结合性GGT两种形式存在［9］。本研究中癌组织总GGT和不同分子形式的GGT,均非常明显地高于癌周和远癌组，且GGT的表达与总RNA浓度存在着不一致性,癌组总RNA浓度明显低于癌周和远癌组,其机制尚不清楚。对肝癌特异GGT同工酶的定量分析，发现肝癌组HS-GGT活性明显升高;除极少数肝硬化或慢性肝炎患者轻度升高外,其余肝病及肝外肿瘤均在正常范围内(表2);对肝癌诊断特异性为87%,且对总GGT明显升高的肝外肿瘤鉴别也具有临床价值［4］；肝癌术后HS-GGT活性明显下降,说明HS-GGT来源于肝癌组织,是反映肝细胞癌变的灵敏标志物。
HS-GGT与AFP的对照研究发现,在AFP浓度高于50ng/ml的肝癌中,HS-GGT异常率为89.7%；在AFP低于50ng/ml的肝癌中,39例异常，占79.6%。说明HS-GGT的表达与AFP浓度无关,它对AFP高浓度或低浓度肝癌的诊断都具有较高的临床价值。本研究所用癌组织多数伴有HBV感染,合并肝硬化达85%，提示HBV感染仍是肝癌发生的主要病原学因素,近半数患者AFP浓度较低,也说明HS-GGT在诊断肝癌方面优于AFP。随着对GGT基因的深入研究,可望成为监测肝细胞早期癌变的灵敏方法［10］。（姚登福 于志坚 蒋道荣 茅国新 吴信华 孟宪镛 中国肿瘤临床2000年3期）