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田利民,刘静,高翠霞   第四军医大学学报 2005 年 7 月 第 25 卷 第 13 期

    Effect of low density lipoprotein on islet cell function

TIAN LiMin, LIU Jing, GAO CuiXia

Department of Endocrine Secretion, Gansu Provincial Peoples Hospital, Lanzhou 730000, China

【Abstract】 AIM: To study the effect of low density lipoprptein (LDL) on the function of islet cell in vitro. METHODS:  Wistar rat islet cells were isolated for cell culture and treated with LDL (from 8 mg/L on) for 48 h. The cells were cultured with low glucose (2.8 mmol/L) and high glucose (16.7 mmol/L). Insulin secretion of rat islet cells stimulated by high glucose was measured by radioemmunoassay. RESULTS:  ① No obvious effect was observed of the islet cells with LDL at low glucose level, while the insulin levels decreased in rat islet cells cultured with high glucose. ② Compared with LDL, the insulin levels of glucose stimulating insulin secretion (GSIS) increased in rat islet cells cultured with LDL combined with vitamins E and C for 48 h. CONCLUSION:  Uptake of LDL by islet cells and subsequent oxidative reactions can damage the cells. This process can be counteracted by antioxidants.

【Keywords】 islet cells; LDL; vitamins E,C

【摘要】 目的：研究低密度脂蛋白对体外培养的胰岛细胞功能的影响.  方法：体外分离培养Wistar大鼠胰岛细胞，并在低糖（2.8 mmol/L）和高糖（16.7 mmol/L）条件下与低密度脂蛋白(LDL)（从8 mg/L开始）培养48 h，应用放射免疫法测定葡萄糖刺激的大鼠胰岛细胞胰岛素分泌量.  结果：①低糖刺激下，LDL对胰岛细胞的胰岛素分泌无明显影响，但在高糖刺激下，胰岛素分泌水平降低. ②LDL和抗氧化剂维生素E, C共同培养48 h，与LDL组比较，高糖刺激下胰岛素分泌水平增加.  结论：胰岛细胞摄入LDL后发生氧化反应，损伤胰岛细胞功能，这一过程可被抗氧化剂抑制.

【关键词】 胰岛细胞；低密度脂蛋白；维生素E,C

0引言

2型糖尿病患者常伴有脂代谢紊乱，以三酰甘油和低密度脂蛋白（low density lipoprotein, LDL）升高，高密度脂蛋白降低为主要特征. 近年来，国内外一些前瞻性研究发现2型糖尿病患者的血脂代谢异常往往出现在糖代谢异常之前. 已有资料表明，在糖尿病大鼠体内，高三酰甘油血症可引起三酰甘油在胰腺内的沉积增加［1-3］，胰腺组织的病理切片显示三酰甘油在胰腺的沉积增加可导致细胞减少至少50%以上［4］. 那么，LDL能否影响胰岛细胞功能，是否为2型糖尿病发生的一个独立危险因素？我们通过体外培养大鼠胰岛细胞，探讨LDL对胰岛细胞功能的影响.

1材料和方法

1．1材料

RPMI 1640培养基，胎牛血清、Hepes购自北京华美公司;胶原酶V，Ficoll400, 双硫腙、维生素E,C和BSA为Sigma公司产品. LDL购自北京协和医科大学生化教研室. 胰岛素放射免疫试剂盒购自北京原子能研究院. Wistar大鼠，雄性，体质量200~250 g，由兰州大学动物实验中心提供.

1．2方法

1.2.1胰岛细胞分离、纯化和鉴定取Wistar大鼠，水合氯醛按7.5 mL/kg大腿肌肉注射麻醉，750 mL/L乙醇浸泡5 min,无菌间超净工作台常规皮肤消毒，沿腹正中线剪开皮肤，充分暴露腹腔，寻找胆总管，并结扎其十二指肠入口处，逆行胆总管插管，注入胶原酶V（1 g/L）约8~10 mL，可见胰腺膨胀，顺序分离胰腺，置预冷的DHanks液（5 mL）中，用DHanks液洗两遍并用眼科镊剪碎胰腺组织. 37℃水浴静置消化20 min后，加入4℃DHanks液终止消化，吹散后过80目网筛，将滤过物800 r/min离心5 min，弃上清后沉淀物中加入Ficoll400梯度离心液（比重1.108,1.096,1.069,1.037），1000 r/min离心10 min，对光亮，用裸眼在1.037与1.069，1.069与1.096层面提取白色粒状悬浮物，用含血清的培养液离心洗两遍，弃去上清夜，双硫腙染色后倒置显微镜下细胞计数，台盼蓝染色观察细胞活性.

1．2．2胰岛细胞培养将纯化的胰岛细胞置于RPMI 1640完全培养基（含150 mL/L胎牛血清，10万u/L青霉素，100 mg/L链霉素，10 mmol/L Hepes）, 37℃,含50 mL/L CO2的饱和湿度培养箱中培养，1 d后通过转皿去除成纤维细胞，接种于24孔板（1×105细胞/孔）中继续培养7 d，每2 d换1次培养液，并于第7日开始加入处理因素. 取一24孔板中生长状态良好的胰岛细胞按实验需要分成5组，每组设4个平行孔，分别加入100 μL浓度为0, 8, 16.5, 33和66 mg/L的LDL. 同步取另一24孔板分为4组，每组同样设4个平行孔，第1组不加处理因素，设为对照组；第2组加入33 mg/L的LDL;第3组加入维生素E（1 μmol/L）和维生素C（50 μmol/L）;第4组依次加入LDL和维生素E,C，浓度同上.  37℃,50 mL/L CO2孵育48 h.

1．2．3葡萄糖刺激的胰岛素释放弃去每孔中原有培养液，用含葡萄糖2.8 mmol/L的KRB液（KrebsRinger buffer,主要含有以下成分：143.5 mmol/L Na+, 5.8 mmol/L K+, 2.5 mmol/L Ca2+, 1.2 mmol/L Mg2+, 124.1 mmol/L Cl-, 1.2 mmol/L PO4H2-, 25 mmol/L CO3H-, 1.2 mmol/L SO4H-, 3 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L Hepes和5 g/L BSA）处理胰岛细胞1 h（饥饿试验），吸取上层培养液待测；再用含16.7 mmol/L葡萄糖的KRB液行高糖刺激实验，继续培养1 h后分别收集上清液. 采用放射免疫双抗体法检测以上留取液中的胰岛素分泌量.

统计学处理：实验数据采用SPSS 10.0统计软件处理. 计量资料采用x±s做描述，多组均数比较采用方差分析，方差不齐的采用KruskalWallis秩和检验. P<0.05为差异有统计学意义.

2结果

2．1胰岛细胞生长状态刚分离纯化的胰岛细胞在倒置显微镜下表现为大小不一的圆形或椭圆形细胞团和散在的单一细胞，细胞团周边形成一完整包膜，边缘清晰，状态较好的单个细胞呈圆形，周边发亮. 双硫腙染色显示大部分胰岛细胞被染成桃红色或红棕色. 台盼蓝染色显示90%以上的胰岛细胞活性良好. 24 h后接种于24孔培养板，培养孔内单个游离细胞增多，培养至第3日，散在细胞继续增多，细胞形状变得不规则，被膜不完整，表明细胞开始贴壁. 第5日，贴壁细胞数量增多，同时培养孔内出现少许细胞碎片，并见分泌颗粒. 培养第7日，可见90%以上细胞贴壁.

2．2LDL对胰岛细胞功能的影响见Tab 1. 在低糖（2.8 mmol/L）刺激下，各组胰岛素分泌量无显著性差异（P>0.05）;在高糖（16.7 mmol/L）刺激下，各处理组胰岛素分泌量与对照组比较有显著性差异（P<0.05）,随着LDL浓度增加，高糖刺激下胰岛素分泌量逐渐下降. 高浓度（33 mg/L）与较低浓度（8，16.5 mg/L）组间比较，胰岛素分泌量显著降低（P<0.05）;与浓度为66 mg/L组间比较，胰岛素分泌量无显著性差异(P>0.05).表1不同浓度低密度脂蛋白作用下胰岛素释放量测定（略）

2．3维生素E,C对LDL介导的胰岛细胞损伤的保护作用（Tab 2）各处理组在低糖（2.8 mmol/L）刺激下，胰岛素分泌量无显著性差异（P>0.05）；在高糖（16.7 mmol/L）刺激下，LDL（33 mg/L）组胰岛素分泌量显著降低（P<0.01）,LDL+维生素E,C组与LDL组比较，胰岛素分泌量明显增高（P<0.01）,而维生素E,C组与对照组间比较，无显著性差异（P>0.05）.表2维生素E,C与LDL共同作用下胰岛素释放量测定（略）

3讨论

我们的实验结果表明，LDL作用于体外培养的大鼠胰岛细胞，可引起葡萄糖刺激的胰岛素释放水平下降，说明LDL可以影响胰岛细胞的功能. Grupping等［5］通过研究描述了在大鼠和人胰腺β细胞上表达高亲和性LDL受体（LDLR），它可以识别和结合所有脂蛋白. LDL可以被胰岛细胞上LDLR结合并摄入. 可见，LDL对胰岛细胞的作用主要发生在胰岛细胞内，并对胰岛细胞具有直接损伤的作用.

Roehrich等［6］研究报道，LDL在较低浓度（3.1 mg/L）作用于体外培养的大鼠胰岛细胞时，可降低胰岛素mRNA的表达，但并不引起β细胞的死亡. 而Cnop等［7］研究认为，当LDL浓度达到25 mg/L时，70%的胰岛细胞死亡. 本研究提示，在高糖负荷下，随着LDL浓度增加，胰岛素分泌量明显下降，但在达到一定浓度（33 mg/L）后，胰岛素分泌量极少. 这说明，在LDL达到一定浓度后，可大大降低胰岛素mRNA的表达，同时损伤了大部分胰岛β细胞的功能.

我们的实验结果还表明，当LDL（浓度为33 mg/L）与维生素E,C混合物共同与胰岛细胞培养48 h后，行葡萄糖刺激实验，发现在高糖负荷下胰岛素分泌量较LDL单独作用时明显增加，说明维生素E,C可对LDL介导的胰岛细胞损伤具有保护作用. 而维生素E的主要生理功能为抗氧化作用，它保护细胞膜中的多不饱和脂肪酸、细胞骨架及其他蛋白质的巯基和细胞内的核酸免受自由基攻击［8］. 维生素C可通过增强内源性抗氧化剂作用和抑制Cu2+等氧化剂结合到载脂蛋白B上来阻止LDL过氧化作用［9，10］. 体外其他组织细胞研究表明，LDL的细胞毒作用与细胞膜摄取脂蛋白有关，所以与LDL相关的氧化反应出现在细胞内，同样抗氧化剂的保护作用也存在于细胞内. 细胞内LDL氧化形成具有活性的胆固醇和脂肪酸超氧化物，并产生自由基反应［11］. 而与其他组织细胞相比，胰腺β细胞内存在较低水平的抗氧化酶，如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶，因此容易受到活性氧族（ROS）和脂质过氧化损伤［12，13］. 这就说明LDL对胰岛β细胞的毒性作用是由LDL对胰岛细胞的氧化损伤造成的. 而在人体内血浆中含有许多抗氧化物质，其中一些可以在胰岛细胞内被活化，保护胰岛细胞；同时，由于高密度脂蛋白（HDL）和极低密度脂蛋白（VLDL）的存在，在一定程度上可以阻止LDL的毒性作用. VLDL的保护作用在于它可以和LDL竞争性结合受体，而HDL可以使LDL氧化过程中产生的脂肪酰化酶失活，使脂肪酸超氧化物生成减少［14］.

已有研究证明，人类和大鼠胰岛β细胞上存在相似的LDL受体，胰岛细胞结合并摄取LDL，最终形成细胞内脂质积聚［5］. 当脂代谢紊乱，尤其是LDL升高，机体处于应激状态，或体内抗氧化能力降低，LDL氧化产生胰岛β细胞毒作用，引起胰岛素分泌水平下降，导致糖代谢紊乱. 这种胰岛细胞的“脂毒性”目前已引起学术界的广泛重视.

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通讯作者：刘静. Tel.(0931)8281695  Email.liujing551108@126.com

作者简介：田利民（1975），男（汉族），甘肃省兰州市人. 住院医师，硕士生(导师刘静). Tel.(0931)8281604Email.tlm6666@sina.com

（甘肃省人民医院内分泌科，甘肃 兰州 730000）