免疫分子与糖尿病

实验技术

免疫分子与糖尿病
发布时间 2007/5/25 点击 2361 次

无论是1型糖尿病还是2型糖尿病，在其发病机制中的遗传与环境因素的相互作用过程，甚至在糖尿病所伴发的大小血管并发症中，都可能涉及免疫分子的参与。这两种类型糖尿病发病机制中的异途同归以及不同免疫分子之间的相互制约与调控对糖尿病发生发展的影响，为人们在一个新的平台上理解糖尿病发病的本质开启了一扇视角之窗。认识免疫分子在糖尿病发病中的意义，不仅有助于理解糖尿病的发病机制，还可能在糖尿病的诊断治疗中提供新的思路。

1 1型糖尿病中的免疫分子

胰岛β细胞的许多成份可以作为特异性自身抗原诱发机体产生相应的抗体。最常见而重要的抗原为谷氨酸脱羧酶(Glutamic acid decarboxylase GAD)，该酶可有两种不同的蛋白分子65Kd及67Kd。此外，β细胞的糖脂蛋白，羧肽酶H，甚至胰岛素均可产生相应的抗体。之所以在I型糖尿病患者体内出现针对β细胞抗原成份的自身抗体，同样遵循自身免疫发生的规律，MHC(主要组织相容性抗原)是决定是否发生1型糖尿病的重要因素。有资料显示HLA-DQ分子是1型糖尿病发生的重要分子，某些HLA-DQ等位基因可以防止发生l型糖尿病，如高加索人DQB链57位上若发生门冬氨酸置换(等位基因DQW3.1，DQW7)则患1型糖尿病的易感性减低，而DQW3.2(DQW8)等位基因则增加1型糖尿病的风险。这同时也说明CD4T细胞在1型糖尿病的发生中或防止中有重要章义。 CD4T细胞在介导对β细胞抗原成分产生抗体时，最先起反应的是针对GAD抗原成分，若抑制这种反应，则不仅取消GAD抗体的产生而且还能阻止1型糖尿病的发生。可见，GAD抗体是1型糖尿病起关键作用的抗体。除了GAD抗体之外，1型糖尿病患者尚有胰岛细胞抗体(Islet cell Antibody，ICA)，胰岛素抗体(Insulin Anto-Antibody，IAA)，胰岛细胞抗原-2抗体(Islet Antigen-2 Antibody，IA-2A)也称蛋白酪氨酸磷酸酶抗体，这些自身抗体出现的频率及先后顺序不一，但对介导胰岛细胞的破坏均是重要的[1]。与其它体细胞不一样，胰岛β细胞表面可在病毒感染及其他环境因素诱导下，异常表达HLA-II类抗原(尤其在HLA-DQa 52arg，HLA-DQβ 57非天门冬氨酸的情况下)，此时β细胞与B淋巴细胞、巨噬细胞一样，具有抗原提呈功能，成为抗原提呈细胞，则可将β细胞自身的HLA—I类抗原成分提呈给T细胞，从而激活特异性T淋巴细胞使B淋巴细胞产生抗体。最近，Mohamed等还发现1型糖尿病患者体内还存在抗心脂抗体，这种抗体尤其在新发生的1型糖尿病患者血清中的水平高，其IgG为29．9±12．60 GPL／ml，IgM为12．8±3．7 MPL／mI，在1岁以上的患者IgG为10．84±5．76GPL／ml，IgM为4.l±2．9MPL／ml。这种抗体与HbA1C、空腹血糖水平、胰岛素剂量都无相关性，但可以作为新发生的1型糖尿病的标志[2]。除了在血清中可以探测到上述一些抗体外，Todd还在1型糖尿病患者的唾液中检测到GAD抗体。他用放射免疫沉淀技术测定GAD血清学阳性l型糖尿病患者的唾液GAD抗体水平，放射活性CPM为6．4％，而血清学阴性患者的CPM为4．7％。这一技术为普通筛查1型糖尿病患者提供了可能。Ahn等比较82例年轻糖尿病患者(23±7岁)发现，空腹C肽水平低的年轻糖尿病患者均有BMI减低及GAD抗体存在。因此认为对于年轻的糖尿病患者，如果空腹C肽水平低，且GAD抗体阳性，应作为诊断1型糖尿病的依据。Pernsicova也认为如果GAD抗体阳性，无论年龄如何，都不能排除1型糖尿病。因此，在临床上许多诊断为2型糖尿病患者，若GAD抗体阳性，且空腹C肽水平低下者应诊断为1型糖尿病[3]。

导致胰岛β细胞破坏和1型糖尿病发生的分子机制至今仍不清楚。目前认为由于一些环境因素的触发，一些易感个体中，启动了细胞因子的产生从而杀伤胰岛β细胞。其中IL-1是重要的细胞毒性因子。在一定剂量围内，IL-1对β细胞有选择性细胞毒性作用，其它细胞因子如IL-6、IFN-γ等则可能有加强其对β细胞毒性作用。无论是用IL-1灌注完整的胰腺或在正常鼠中进行的体内试验均证明IL-1可抑制胰岛素的分泌。在1型糖尿病的发病过程中，浸润胰岛中的巨噬细胞可以产生IL-1，后者导致胰腺β细胞形成一氧化氮（NO），硝基鞘氨醇，前列腺素，热休克蛋白以及蛋白酶的活化。上述这些变化，只有NO的形成才构成对β细胞的毒性作用。除此之外IL-1尚能抑制胰岛β细胞的能量代谢，抑制胰岛细胞基因的表达，减少β细胞内cAMP的合成。如果阻断NO的形成可防止β细胞的毒性作用，这说明，由IL-1介导的N0增加是造成有关后续过程的关键所在。有学者观察IL-1对人鼠胰岛β细胞早期形态学的影响时发现，IL-1可导致胰岛β细胞的肿胀和微绒毛样改变，认为这是IL-1导致胰岛p细胞凋亡的早期改变，这种作用是由IL-1与胰岛β细胞IL-1受体I的结合所至。除此之外，高糖可诱导胰岛β细胞产生IL-1B，而后者可直接对胰腺β细胞产生毒性作用[4]。

除了IL-l外，IL-12，干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)也能抑制胰腺β细胞的功能。而用IL-12的拮抗剂或将CD4+T淋巴细胞耗竭，减少产生IFN r或IL-12，则可延缓大鼠糖尿病的发生[5]。抗IFN-γ的单抗亦可阻止胰岛炎的发生。IL-6对胰岛β细胞功能的影响则较复杂。而且，除了浸润于胰岛的T细胞产生IL-6外，胰岛细胞本身尚可编码产生IL-6，并以旁分泌机制促进胰岛细胞分泌胰岛素，然而如果IL-6产生过多，则其可以单独或者与IL-1协同对胰岛β细胞产生细胞毒作用，尤其是IL-6抑制了胰岛β细胞内DNA含量和胰岛素的合成。在病理情况下如病毒感染或浸润胰岛的炎性细胞增多，产生细胞因子增多的情况下，均可使胰岛β细胞局部产生IL-6增多，从而产生对胰岛β细胞的毒性作用[6]。IL-4，作为Th2细胞产生的细胞因子，对1型糖尿病的发病起保护作用[7]，如果用IL-4的单克隆抗体或可溶性IL-4受体中和IL-4的作用，则促进1型糖尿病患者胰岛炎的发生。如果用NOD小鼠的骨髓细胞进行转基因处理引进EA基因的嵌合体，在提高外周IL-4水平的同时，也使实验动物的胰岛细胞炎显著少。Lee等应用可生物降解的含IL-4质粒的多聚4-丁氨脂酸复合体静脉注入NOD小鼠，该质粒可在肝细胞内产生IL-4，并能显著改善胰岛细胞炎[8]。IL-10也与IL-4相似，可以减低患1型糖尿病的危险性。在一项选用分别罹患或未患1型糖尿病的单卵双胞胎进行的研究中，发现在这些双胞胎中，1型糖尿病发病与否取决辅助细胞2型细胞因子IL-4，IL-1O的多少，如果IL-4，IL-10水平高，则发生1型糖尿病的危险性变小。

2 肿瘤坏死因子在胰岛素抵抗与2型糖尿病中的作用

肿瘤坏死因子(TNF-α)是一种重要的调节机体免疫功能和代谢过程中的多功能细胞因子。自1975年Carswell发现由内毒素激活的巨噬细胞产生的一种对肿瘤细胞有杀伤作用的因子并命名为肿瘤坏死因子以后，中外各国学者对TNF进行了广泛的研究，并陆续发现了除巨噬细胞以外的其它细胞亦能产生TNF以及TNF在杀伤肿瘤细胞以外的许多生物学功能，如参与机体炎症、免疫应答的调节、休克、发热、多器官功能衰竭等。1993年，Hotamisligil发现脂肪细胞可以表达TNFmRNA并与肥胖和胰岛素抵抗相关联，从而提示TNF与胰岛素抵抗和糖尿病的可能关系。

无论是肥胖啮齿动物还是肥胖患者都程度不同地存在胰岛素抵抗，其中重要的介导因子就是TNF。日本Katsuki[9]选择12例患有2型糖尿病的肥胖患者比较其与非肥胖的2型糖尿病及正常对照者的TNF-α水平及其与含脂丰度及胰岛素抵抗的关系，发现肥胖的2型糖尿病患者，血清TNF-α水平明显高于正常或非肥胖2型糖尿病患者，且其TNF-α水平均与体脂丰度呈正比相关；肥胖2型糖尿病患者TNF-α与葡糖糖代谢速率呈负相关。在有胰岛素抵抗或糖尿病患者，骨骼肌所表达的TNF-αDNA比非胰岛素抵抗者高4倍，这种增高的TNF-α与葡萄糖代谢之间存在显著的负相关。将存在胰岛素抵抗患者的肌肉细胞行体外培养，同样发现培养上清中比正常对照者TNF-a水平高出3倍多。瑞典学者Arner认为[10]：肥胖的老年2型糖尿病患者中胰岛素抵抗与胰岛素分泌缺陷都存在，而在较瘦的老年2型糖尿病患者中，胰岛素分泌缺陷似乎更占优势。他采用增高的空腹血浆胰岛素水平表示胰岛素抵抗时，发现肥胖患者脂肪组织表达更高水平的TNF-α，且与胰岛素抵抗相关。40例新发现的7O岁以上老年人2型糖尿病患者，其中20名患有典型的胰岛素抵抗，另20例患者有严重的胰岛素抵抗，比较其与20名年龄匹配的正常老人的血清TNF-α的水平，发现无论是典型的胰岛素抵抗患者还是严重的胰岛素抵抗患者，其血TNF-α水平显著高于正常对照(分别是4．0±1．53pg／ml、3．27±0.79pg／m1)，而且TNF-α体重指数、空腹血糖水平及血脂水平密切相关，与HDL-ch水平负相关。

然而，也有人认为血清TNF-α水平与糖尿病患者性别相关而与体重指数不相关。Preiffer[11]检测105名成年人血清TNF-α水平，发现非糖尿病的正常男性TNF-α比正常人显著增高，患2型糖尿病的成年女性TNF-α水平与正常人相比无明显差异。关于2型糖尿病的非糖尿病子女及糖尿病的高危人群是否也存在TNF-α与胰岛素敏感性相关的问题，Kellerer也作过探讨，他分析了36名德国人和47名芬兰人(系2型糖尿病患者的非糖尿病后代)的血清TNF-α水平及Leptin水平，测定葡萄糖代谢速率，籍以评定胰岛素敏感性，测时测定标准体重百分比。发现，尽管线性回归分析提示TNF-α与糖代谢速率和标准体重百分比都有依赖关系，但在多元线性回归分析中，仅TNF-α与标准体重百分比有意义。而TNF-α与LeDtin之间无相关。从而表明在2型糖尿病的非糖尿病后代中，TNF-α水平所起的影响胰岛素敏感性的作用不突出。关于糖尿病并发症与TNF-α水平关系，Preiffer认为，视网膜病变的存在与TNF增加相关，而神经病变、肾脏病变或大血管与TNF-α水平不相关。TNF-α还与妊娠糖尿病的胰岛素抵抗及发病有关[12]。

人们不仅发现胰岛素抵抗和2型糖尿病与TNF-α水平相关；而且也探讨了TNF影响胰岛素抵抗的一些机制。TNF-α水平对葡萄糖运载体4(GLUT4)的下调作用影响葡萄糖进入组织细胞内进一步代谢，后者主要由一些结构相关葡萄糖运载体(GLUT)介导，其中GLUT4只在胰岛素作用的周围靶细胞(如肌肉、脂肪)表达，参与胰岛素介导葡萄糖的摄取。若将TNF-α与鼠的3T3—L脂肪细胞系长期作用可发现该细胞体外产生GLUT4蛋白量下降。TNF-α通过降低GLUT4的表达从而降低了胰岛素介导的葡萄糖的摄取，引起周围组织尤其是脂肪组织的胰岛素抵抗。

TNF-α对胰岛素受体酪氨酸磷酸化的影响研究表明，TNF-α导致胰岛素激发的胰岛受体自身磷酸化作用下降20.5％，而胰岛素受体底物—1磷酸化下降效应更明显。Kellrer曾对比研究TNF-α与急性高糖对转染胰岛素受体的游离细胞系统酪氨酸激酶活性的影响。结果显示了TNF-α如高糖一样对胰岛素受体的抑制性效应源于蛋白C的激活，后者可导致胰岛素受体亚基丝氨酸残基的磷酸化，从而干扰了胰岛素受体的酪氨酸酶磷酸化。胰岛素受体对高糖和TNF-α的抑制性效应起反应的区域位于胰岛素受体的C末端或膜区域内；这种抑制效应可被蛋白酶C抑制或胰岛素增敏剂(如噻唑烷二酮)所拮抗。如果用可溶性TNF受体抗体中和TNF-α的作用后，zucker(fa／fa)大鼠的脂肪细胞和肌肉的胰岛素受体酪氨酸激酶活性可以恢复，同时，胰岛素受体底物-1磷酸化也恢复正常对照的水平。而细胞的胰岛素受体酪氨酸磷酸化水平并未改变。此外，TNF-α还可以通过刺激脂肪分解抑制脂肪酸的合成或通过其它细胞产生一些拮抗胰岛素的物质(如糖皮质激素)减少瘦素的水平产生胰岛素抵抗[13]。

3 免疫调节治疗糖尿病的探索

鉴于TNF在介导胰岛索抵抗中的重要作用，人们开始设想拮抗TNF，从而缓解TNF所致的胰岛素抵抗。TNF拮抗剂的种类大体有：①抗TNF抗体，其作用机理主要是通过与TNF特异结合而阻断TNF生物活性，同时促进机体对TNF的免疫清除过程。如小鼠抗重组人TNF的单克隆抗体B-C7，UB006，CDP571等。②抗TNF受体抗体，55Kd TNF受体即TNF受体I，几乎介导了全部TNF生物活性。现已制备出抗55Kd受体的单克隆抗体可全部阻断TNF的生物作用。③TNF受体-IgG重链嵌合蛋白。将编码人55kdTNFR的膜外区的cDNA顺序与小鼠IgGI重链Fc部分及绞链区的DNA顺序，通过一段编码凝血酶敏感肽的DNA序列连接起来，由CHO细胞表达分泌一种嵌合蛋白，这种蛋白作为TNF的抑制剂，其拮抗TNF效力甚强。④可溶性TNF受体。TNF的两大类受体都能以可溶性形式存在(分别称为Stnfr.I和sTNFR.II)，在机体产生TNF时，sTNFR也从细胞膜表面脱落下来与膜TNFR竞争结合TNF，从而阻断TNF的生物活性。Ofei[14]曾用一种重组人基因工程TNF-α的单克隆抗体CDP571，以每公斤5mg的剂量每周静脉注射1次，共6周治疗2型糖尿病患者，比较治疗前后胰岛素敏感度的改变(以空腹胰岛素和每分钟葡萄糖清除率来评价)，结果发现在4周内，上述治疗并不影响胰岛素敏感度。也许是其治疗和观察时间的限制。用可溶性TNF受体-IgG嵌合蛋白中和zucker(fa／fa)大鼠模型的TNF-α，肌肉细胞和脂肪细胞胰岛素受体及胰岛素受体底物-1的酪氨酸磷酸化水平显著提高，甚至恢复对照瘦型大鼠的水平。

除了TNF拮抗剂外，一些学者也探讨了胰岛素增敏剂是否通过影响TNF而发挥治疗作用，应用帕格列酮治疗Wistar肥胖大鼠。该种肥胖大鼠除了有高血糖、高胰岛素血症外，其血浆及肌肉TNF-α水平也增高。帕格列酮可以通过降低TNF-α水平而改善胰岛素敏感度。已有资料表明，噻唑烷二酮类可以下调脂肪细胞的TNFα基因及Leptin基因。在体外用梯度剂量的TNF-α诱导H 411E脂肪细胞系的胰岛素抵抗（以CaM mRNA和糖利用能力表示)。再加二甲双胍和帕格列酮至体外细胞系统，发现二甲双胍和帕格列酮可以逆转由于TNF-α诱导的胰岛素抵抗。但二甲双胍单独是否影响TNF-α水平仍不清。用二甲双胍治疗2型糖尿病患者，发现12周后肥胖2型糖尿病患者TNF-α增加33％，而非肥胖患者TNF-α增加68％，故二甲双胍并非通过TNF-α水平而影响胰岛素抵抗。但有关机制仍需探讨。

既然1型糖尿病被认为是一种自身免疫性疾病，理论上来说应该可以通过抑制自身免疫反应，调节免疫达到治疗1型糖尿病的目标。事实上在这方面，人们一直在进行着探索。在新诊断的1型糖尿病患者中，用环孢霉素治疗能显著保护胰岛功能，但长远的结果并不理想。口服烟酰胺也能在一定程度上改善胰岛细胞炎，但不能缓解病情的发展。也有学者在具有高危1型糖尿病人群，即l型糖尿病患者的一级亲属和二级亲属中胰岛细胞抗体阳性者，进行胃肠外胰岛素治疗，但并不能延缓糖尿病的发生。由于l型糖尿病患者体内l型T辅助细胞的细胞因子如IL-1、IL-6、IL-2、INF-r等是导致胰岛β细胞破坏的主要因素，而2型T辅助细胞产生的细胞因子IL-4、IL-10具有保护胰岛β细胞的作用。人们试图运用调节1型T辅助细胞亚群达到治疗l型糖尿病的目的。美国学者运用CD3T细胞的单克隆抗体治疗早期1型糖尿病患者，可大大降低l型T辅助细胞及其产生的细胞因子，与此同时，胰岛素水平保持不进一步降低。甚至有所提高，更为奇异的是，这种治疗不仅降低了1型T细胞的功能，还同时强化了2型T辅助细胞的功能，从而保护了胰岛β细胞不遭受进一步攻击[15]。

免疫分子在1型和2型糖尿病中均扮演角色的事实显示了这2种既往认为不同类型的糖尿病实际上有着内在联系，破译这种内在联系，探索新的治疗方法，无疑对拓展糖尿病治疗学的内涵及外延具有开创性意义。

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[来源：来宝网]

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