|
1 引言
血脂异常是动脉粥样硬化的重要危险因素，要有效开展心血管病防治和研究工作，必须做到血脂分析标准化。标准化工作的核心是量值溯源，即通过一系列对比测量，使各常规分析与一公认的国际标准相联系。公认标准的具体体现即所谓的参考系统，一般包括参考方法和参考物质两方面。临床检验的量值溯源，是临床诊断和治疗疾病的需要，在欧洲也将成为法律要求。欧洲议会和理事会1998年10月签署一项将于2003年12月生效的关于体外诊断器具的导师（Directive 98/79/EC），该导则的一项关键内容是要求临床检验校准物质和/或质控物质定值的溯源性，必须通过己有的高一级的参考方法和/或参考物质予以保证。要开展量值溯源或标准化工作，首先要建立一个可靠的参考系统作为准确性基础，再通过一定手段将准确性转移到常规分析中去，或使常规分析结果可溯源到参考系统作为准确性基础上来。因此血脂分析标准化有两个主要内容，一是参考系统，二是将常规分析与参考系统相联系的过程，一般称为标准化计划。本文将简单介绍血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密脂蛋白胆固醇（LDL-C）、载脂蛋白AI和B（apoAI和apoB）和脂蛋白（a）[Lp(a)]参考系统与标准化计划的国内外研究进展与现状。
2 血脂、脂蛋白、载脂蛋白测定参考系统
按国际标准化组织（ISO）1999年起草的关于临床检验量值溯源性的标准檔ISO/CD 17511，完整的参考系统包括一级参考测量过程、一级参考物质、二级参考测量过程和二级参考物质等。一级参考测量过程主要用于一级参考物质的制备，是具有最高计量学特性的测量过程，但在不少情况下不适合于基质复杂的生物样品的分析。一级参考物质是测量单位的体现体，一般是高度纯化的被分析物质，主要用于二级参考测量过程的校准。二级参考测量过程是高度特异的、适合于复杂基质样品分析的准确测量过程，可利用多种可靠的分析原理，大致可分为两个层次，利用同位素稀释/质谱（ID/MS）原理的测量过程多称为一级测量方法（欧洲）或决定性方法（美国），而利用其它可靠原理的方法称参考方法。二级参考测量过程主要用于二级参考物质的制备和常规方法的直接评价等。二级参考物质一般具有与实际样品相同或相似的基质，主要用于量值传播。各种二级参考方法和二级参考物质是临床检验标准化工作中的主要角色。
具备完整参考系统的检验指针，其量值可溯源至国际单位制（SI）单位（基本或导出单位），SI单位国际通用，不随时间和空间的变化而变化，因此溯源至SI单位量值溯源的理想情况。目前国际上能溯源至SI单位的血脂指针只有TC和TG，而其它指标则由于被分析物的复杂性，其量值溯源只能停止，在较低水平。
2.1 TC测定参考系统
TC在国际上，尤其在美国，是参考系统最完整，标准化工作开展最早、成效最显著的临床检验指标。美国TC参考系统包括国家标准与技术研究所（NIST）的决定性方法（采用ID/MS原理）和一级参考物质（SRM 911b）及疾病控制与预防中心（CDC）的Abell-Kendall（A-K）参考方法和多种二级参考物质。其中国际影响较大的是CDC的AK参考方法，因它一直是已有几十年历史的国际血脂标准化计划（见下文）中的胆固醇参考方法。此法精密度达到CV小于1%，具有较高的特异性，但受血清中其它的甾醇的干扰，测定结果比决定性方法结果高约1.6%。此法除用于TC测定外，也用于HDL-C和LDL-C参考方法（见下文）中的各项胆固醇测定。此法最近的变化是取样量由原来的0.5mL减少为0.25mL，目的是为了适用于小样品量HDL-C和LDL-C参考方法中的胆固醇测定。欧洲部分国家[CDC胆固醇参考方法实验室网络（CRMLN）（见下文）成员国家]使用AK法作胆固醇参考方法，部分国家使用ID/MS法。我国也已建立较完整的胆固醇参考系统，由胆固醇纯度标准物质（GBW0920a和GBW09203b）（一级参考物质）（卫生部北京老年医学研究所和国家标准物质研究中心）、高效液相色谱（HPLC）参考方法及血清标准物质（GBW09138）（二级参考物质）（卫生部北京老年医学研究所）组成。
2.2 TG测定参考系统
血清中与TG有关的是一组化合物（TG、甘油二酯、甘油一酯和游离甘油），其测定比胆固醇复杂得多，虽然也已具备完整的参考系统，但各水平上的测定质量不如胆固醇。目前绝大多数TG常规测定用酶法测定是总甘油测定（包括TG和游离甘油等），有时用内游离甘油空白法或外游离甘油空白法测定TG。因此TG参考方法应至少能准确测定总甘油、TG和游离甘油三种被测物中的两种，这样才能满足各种TG测定的标准化要求。美国TG参考系统包括NIST的决定性方法和一级参考物质（SRM1595，三软脂酸甘油酯）及CDC的参考方法和多种二级参考物质。NIST的决定性方法由两部分组成，分别是基于ID/MS原理的TG测定法和总甘油测定法。CDC的TG参考方法也分两部分，一部分是二氯甲烷提取-硅酸吸附-变色酸显色TG测定法，另一部分ID/MS游离甘油测定法。由于TG测定中的变色酸显色反应步骤多、需要强酸试剂，最近CRMLN拟将此步（甘油测定）改为酶法。除CRMIN成员外，欧洲TG参考方法主要是ID/MS总甘油测定法，我国已建立总甘油和游离甘油的HPLC测定法。
2.3 HDL-C和LDL-C测定参考系统
血清不同脂蛋白迫害间没有明确的界限，其理化性质存在一定重迭，定义和准确测定脂蛋白胆固醇非常困难，故目前HDL-C和LDL-C无一级参考物质，也无一级参考测量过程或决定性方法，国际影响较大的参考方法是CDC的超速离心-化学沉淀法。用超速离心法去除血清中密度小于1.006的组分（顶部组分，主要为乳糜微粒和极低密度脂蛋白），测定底部组分（BF）胆固醇（BF-C），用肝素-锰离子试剂沉淀BF中的LDL，测定上清液中的HDL-C，从BF-C中减去HDL-C得LDL-C。BF-C和HDL-C的测定均采用AK法。LDL-C中包括Lp(a)和中间密度脂蛋白胆固醇。此法过去的样品（血清）用量一直是5mL，应用不便，故CDC近年来在减少该法样品量方面做了大量研究工作，建立两种样品量为2mL的HDL-C和LDL-C测定法，估计将取代原5mL方法。有关此法的另一项最新研究是其温度效应，超速离心温度对BF-C和HDL-C均有影响。HDL-C随温度的变化，初步认为是卵磷脂胆固醇酯酰基转移酶（LCAT）和胆固醇酯转移蛋白（CETP）综合作用的结果，而BF-C的差异可能与脂蛋白密度随温度变化而变化有关。这些研究结果表明，目前的HDL-C和LDL-C参考方法还不十分完善，需在澄清各主要影响因素并对各主要脂蛋白的定义形成统一意见后作进一步改进。目前卫生部北京老年医学所正着手研究HDL-C和LDL-C参考方法问题。
2.4 Apo AI、apoB和Lp(a)测定参考系统
ApoAI、apoB和Lp(a)常规测定目前基本上都是基于免疫学原理的蛋白测定，其标准化问题非常复杂，CDC早期曾研究apoAI和apoB标准化问题，近年建立apo AI的ID/MS侯选决定性方法。目前国际影响较大的apoAI和apoB和Lp(a)标准化研究是由国际临床化学联合会（IFCC）组织、美国西北脂类研究室（NWLRL）牵头的参考物质[SP1-01、SP3-07和Lp(a)PRM]研究。SP1-01、SP3-07和Lp(a)PRM的定值分别为1.50±0.08g/L、1.22±0.02g/L和107.1±8.6nmol/L，定值方法为CDC的放射免疫分析法、NWLRL的免疫散射比浊分析法和酶联免疫吸附分析法，定值所用校准物（一级参考物质）为欧共体标准局（BCR）认证参考物质CRM393（纯化apoAI）、密度1.03-1.05的纯化LDL和两种纯化Lp(a)。SP1-01和SP3-07已在apoAI和apoB标准化中发挥了较明显的作用，被世界卫生组织（WHO）标准化专家组接受为WHO-IFCC国际参考试剂。用Lp(a)PRM标准化Lp(a)测定的效果还不十分理想，主要原因不在于PRM，而在于目前不少Lp(a)测定法对Lp(a)多态性敏感。该PRM作为WHO-IFCC国际参考试剂的工作正在进行中，故目前仍为推荐参考物质（PRM）。
3 血脂、脂蛋白、载脂蛋白测定标准化计划
如前所述，标准化计划是将常规分析与参考系统相联系的过程，有两种主要方式，即应用参考物质和应用参考方法。应用参考物质相对简便，故是最常用的方式[如CDC-国家心肺血液研究所（NHLBI）]血脂标准化计划和室间质评计划等]。这种方式的可能问题有两方面，一是基质效应，有些参考物质对于某些常规方法，其行为与新鲜样品不同，在这种情况下用参考物质校准的分析系统分析实际样品时必然产生误差；另一方面是参考物质一般品种有限，在浓度和样品成分（包括可能干扰因素）方面不具备足够的代表性，因而不能有效地鉴定和修正某些分析问题（如特异性、线性等方面的问题）。应用参考方法，即用参考方法和常规方法同时分析足够数量的、有代表性的、分别取自不同个体的实际新鲜样品，是最有效的标准化方式[如CDC胆固醇参考方法实验室网络（CRMLN）血脂标准化计划]，但此方式复杂，受有无参考方法可用的限制。
3.1 CDC-NHLBI血脂标准化计划
此计划是国际上历史最长、影响最大的血脂标准化计划，其对象是流行病学实验室、血脂方法学实验室、质评计划和生产厂家中的参考实验室等。为避免或减小可能的基质效应，本计划用冰冻血清传递量值，血脂指标包括TC、TG和HDL-C本计划分3阶段：第一阶段为初步评价阶段，评价申请者的分析质量及所有分析系统对CDC血清有无基质效应，申请者分析CDC提供的冰冻血清，同时分析新鲜病人血清，将分析结果连同所分析的新鲜血清送CRMLN实验室。第二阶段为主要评价阶段，评价申请者血脂分析的精密度和准确度及维持分析质量的能力，申请者分析CDC血清多次。第三阶段是使参加者长期保持分析质量，参加者每季度分析CDC血清。目前我国有卫生部北京老年医学研究所、阜外医院、广州心血管病研究所等单位的实验室参加此计划。
3.2 CRMLN血脂标准化计划
鉴于有些常规分析系统对参考物质有基质效应，用参考方法和常规方法同时分析新鲜样品是最有效的建立和保证常规分析准确性的途径，CDC于1989年建立CRMLN，向血脂分析试剂生产厂家和临床实验室提供标准化服务。该网络进行参考测量的血脂指标，除胆固醇外，还包括高密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯，部分成员实验室也分析低密度脂蛋白胆固醇。成员实验室间的质量控制（分析CDC提供的多种冰冻血清）每两月进行一次。该网络目前由5家美国实验室和6家国际实验室组成，国际实验室有欧洲3家（英国、荷兰、意大利），南、北美洲各1家（阿根迁、加拿大），和亚洲1家（日本）。我国卫生部北京老年医学研究所血脂研究室2002年3月被接纳为网络成员，成为第7家CRMLN国际实验室。
3.3 ApoAI、apoB和Lp(a)标准化计划
ApoAI、apoB和Lp(a)标准化计划目前主要是WHO-IFCC的分析系统校准过程。NWLRL提供参考物质、质控物质和新鲜冰冻血清，校准过程分3阶段，第一阶段用WHO-IFCC参考物质作校准物，分析NWLRL质控物，判断本地分析系统有无基质效应、线性如何等；第二阶段用WHO-IFCC参考物质作校准物，分析本地校准物，为本地校准物定值，再用新定值本地校准物作校准物，反过来分析WHO-IFCC参考物质及NWLRL质控物；第三阶段新定值的本地校准物作校准物，分析NWLRL新鲜冰冻血清（40份）。此校准过程主要面向试剂或分析系统生产厂家和血脂参考实验室。我国卫生部北京老年医学研究所1996年完成此过程。
3.4室间质评计划
室间质评计划也是重要的标准化计划，在评价和提高实验室间分析结果可比性方面一直发挥着重要作用。质评物质的基质效应曾影响室间质评计划的有效性，但此问题可通过使用与新鲜样品性质更接近的质评材料，或研究不同分析系统的基质效应得以解决。
4 结语
由于血脂异常与心血管病之间的密切关系，包括我国在内的许多国家均已提出统一的血脂异常诊断和治疗标准。这些标准的采用显然需要血脂测定标准化。本文讨论内容主要是测定过程的标准化问题，在利用血脂测定结果进行危险性分析、做医海陆空决定和判断治疗效果时还应考虑到许多分析前影响因素，如采样前病人准备、样品采集与处理、生物学变异等。标准化工作是一项系统工程，它的有效开展需要临床、检验和研究工作者及有关组织和机构等的共同努力。
摘自《2002年全国血脂分析与临床学术研讨会论文汇编》 |