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1.标本：留取机关体检的正常人血清标本及部分高总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG） 患者血清96份。

2.试剂：(1) 本室研制的RⅠ液：聚阴离子、多聚体、表面活性剂、4-氨基安替比林。RⅡ液：胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、表面活性剂、酚衍生物。校准血清：新鲜混合血清用DS-Mg法定值。(2) 日本第一化学药品株式会社生产的HDL-C直接测定试剂盒(Lot No 006RCV)，由前处理液RⅠ、酶液RⅡ组成。第一化学校准品，HDL-C测定专用(Lot No 004RBU)。 (3)TC、TG测定用酶试剂，磷钨酸镁法试剂盒，北京中生公司出品。(4)DS50（分子量50 000）法国Sochibo产品（Lot No 10003）。(5)氯化镁含6H₂O，优级纯，北京化工厂生产。(6)纯低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白(HDL)：用超速离心法从人血清中分离，由卫生部北京老年医学研究所生化室提供。

3.仪器：日本Olympus AU 600自动分析仪，日立7060 、7170 自动分析仪，BM 4010光度计，Beckman DU530 分光光度计。

关键词： 脂蛋白类；HDL胆固醇；均相法 【摘要】 目的 研制高密度脂蛋白胆固醇均相法测定的试剂。方法 利用多聚体和聚阴离子在表面活性剂的作用下对脂蛋白进行选择性遮蔽，仅使高密度脂蛋白中的胆固醇参与胆固醇反应。结果 研制的试剂(Y)与推荐方法DS50-Mg(X₁)和PTA-Mg沉淀法(X₂)相关良好，分别为Y=1.040X₁-0.063，r=0.988 3；Y=0.944X₂+0.073，r=0.965 7。在HDL-C浓度为2.84 mmol/L以下线性良好，r=0.998 2，HDL-C低、中、高值血清标本的批内和批间(CV)值分别为2.07%、1.81%、0.80%和2.77%、1.97%、1.73%，特异性好，平均回收率为98%，胆红素、血红蛋白等干扰不明显。结论 HDL-C均相法测定结果的准确性与精密度符合临床要求。 Homogeneous assay for measuring serum high-density lipoprotein cholesterol GAO Delu^*, ZHANG Shijun, LI Peiying. ^* PLA 305^th Hospital, Beijing 100017 【Abstract】 Objective To prepare the homogeneous assay reagents for measuring high-density lipoprotein cholesterol and its analytical performance.Methods Selective inhibition assay principle was applied in the enzymatic determination of HDL-cholesterol. appropriate quantities of polymer, polyanion, surfactants, and cholesterol enzyme reagents were used in the two regent solutions.Results The directly determined HDL-C values with the home-prepared reagent (Y) closely correlated with those obtained by precipitation with DS-Mg(X₁)(Y=1.040X₁-0.063) and PTA-Mg (X₂)(Y=0.944X₂+0.073) methods. The assay was linear up to at least 2.84mmol/L(r=0.998 2).The within-run CV and between-run CV at low、middle、high HDL-C concentration specimens were 2.07%, 1.81%, 0.80%, and 2.77%, 1.97%, 1.73% respectively. The average recovery rate of the added pure HDL was 98%. Interference by bilirubin and hemoglobin was insignificant.Conclusion The precision and accuracy of HDL-C determination with this homogeneous assay method can fulfill the clinical requirement. 【Key words】 Lipoproteins, HDL cholesterol Homogeneous assay 高密度脂蛋白胆固醇均相法（HDL-C homogeneous methods）测定通称直接法(Direct Method)测定。由于标本不需预处理，可用自动分析仪检测，适合于大规模流行病学调查及工作量大的实验室使用，且具有标本用量少、快速、简便、精密度高等优点，因而日益为临床实验室采用。直接法的应用无疑是常规测定方法的革新。随着自动分析仪的普及，直接法取代沉淀法已是必然趋势。由于目前无国产试剂，所以各种类型的进口试剂价格昂贵，鉴于上述情形，我们认为应该开发国产试剂，希望能逐步地替代进口产品。经过一年半的研究，终于研制出了不同于国外试剂成分，并适合我国国情的高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)均相法试剂，经与用作参考方法的硫酸葡聚糖镁沉淀（DS-Mg）法、我国检验学会推荐的磷钨酸镁沉淀(PTA-Mg)法及日本第一化学药品株式会社（简称日化试剂）的均相法比较，基本一致（偏差＜0.68%）。 该试剂的测定原理是:第一试剂（RⅠ）中聚阴离子和多聚体在表面活性剂的作用下，使得除高密度脂蛋白(HDL)以外的脂蛋白形成稳定的复合物；第二试剂（RⅡ）中的表面活性剂、酶及色原则可使HDL释放出胆固醇(CHO)，从而测出高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的含量。 材料与方法

1.标本：留取机关体检的正常人血清标本及部分高总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG） 患者血清96份。

2.试剂：(1) 本室研制的RⅠ液：聚阴离子、多聚体、表面活性剂、4-氨基安替比林。RⅡ液：胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、表面活性剂、酚衍生物。校准血清：新鲜混合血清用DS-Mg法定值。(2) 日本第一化学药品株式会社生产的HDL-C直接测定试剂盒(Lot No 006RCV)，由前处理液RⅠ、酶液RⅡ组成。第一化学校准品，HDL-C测定专用(Lot No 004RBU)。 (3)TC、TG测定用酶试剂，磷钨酸镁法试剂盒，北京中生公司出品。(4)DS50（分子量50 000）法国Sochibo产品（Lot No 10003）。(5)氯化镁含6H₂O，优级纯，北京化工厂生产。(6)纯低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白(HDL)：用超速离心法从人血清中分离，由卫生部北京老年医学研究所生化室提供。

3.仪器：日本Olympus AU 600自动分析仪，日立7060 、7170 自动分析仪，BM 4010光度计，Beckman DU530 分光光度计。

.方法：(1)TC、TG上机用酶法测定。(2)本室研制的HDL-C试剂于Olympus自动分析仪操作如下：血清3 μl，RⅠ试剂300 μl 37℃反应3分钟（其它自动分析仪或分光光度计5分钟，余均同），RⅡ试剂100 μl 37℃ 反应5分钟，主波长520 nm，副波长660 nm，用吸光度差进行计算。(3)日本第一化学药品株式会社生产HDL-C试剂：主波长600 nm，副波长700 nm，余均同（2）。(4)沉淀方法：DS-Mg法及PTA-Mg法，按文献操作^［1，2］。结果

一、方法性能评价

1.反应曲线：用本法测定低、中、高3种浓度（0.90、1.40、2.40 mmol/L）血清，在加入RⅡ试剂反应5分钟基本达到终点，3种浓度的血清反应速度一致，见图1。

图1 HDL-C均相法的反应曲线 2.剂量响应曲线：(1)HDL-C高值新鲜血清(1.95 mmol/L)。(2)冰冻血清与HDL纯品的混合物（2.34 mmol/L）。(3)HDL纯品(2.84 mmol/L)分别用生理盐水稀释，使含1/5、2/5、3/5、4/5及原物质。用本法测定，在此范围内线性关系良好。图2示1：r=0.998 5、2：r=0.996 7、3：r=0.998 2。 3.特异性：目的为检测试剂是否专对HDL-C反应，而LDL-C不参与反应。(1) 取LDL纯品（LDL-C 19.50 mmol/L）直接测定，结果显示LDL不与试剂发生反应。(2) 在1份血清(TC 4.58 mmol/L、LDL-C 2.66 mmol/L、TG 1.25 mmol/L、HDL-C 1.35 mmol/L)中加入不同量的 LDL［LDL-C为(0.06～2.50) mmol/L］，共组成10种浓度，使TC 、LDL-C最终浓度分别达到7.08和5.16 mmol/L。图3示在TC 6.20 mmol/L、LDL-C 4.28 mmol/L时，本法和日化试剂测出的HDL-C值开始下降，分别下降6.7%和8.0%（0.09 mmol/L和0.11 mmol/L），上述结果表示加入LDL不会使HDL-C测定值增高，至于HDL-C下降的问题，涉及到LDL引起浑浊所造成的干扰（见讨论）。 稀释度 图2 HDL-C均相法的剂量响应曲线 管号 图3 LDL对HDL-C两种测定方法的影响 4.回收率：取两份低、高值HDL-C血清（0.96 mmol/L、1.84 mmol/L），以不同比例混合，使其浓度分别为1.13 mmol/L、1.27 mmol/L、1.42 mmol/L、1.56 mmol/L、1.63 mmol/L和1.70 mmol/L，回收率分别为98.2%、95.3%、98.9%、98.7%、100.6%和97.6%，平均回收率为98.2%。 5.精密度：取低、中、高3种HDL-C混合血清，测定批内和批间的精密度，所得结果精密度好，见表1。该精密度完全符合美国国家胆固醇教育计划（NCEP）对HDL-C测定的要求。 表1 本法的批内及批间变异(n=10)

直接法因无需沉淀步骤，血清可直接上机测定，精密度高于沉淀法。实验证明，本室研制的HDL-C试剂，准确度、精密度良好，最低检测下限极低（接近零），与DS-Mg法及PTA-Mg法比较，偏差分别为-0.68%及+0.60%，总误差＜6%，完全达到NCEP提出总误差＜13%的目标^［3］。测定线性范围能达到临床要求，不受胆红素(＜200 mg/L)、血红蛋白(＜7.5 g/L)的影响。

本法特异性好，高浓度的LDL纯品（LDL-C 19.5 mmol/L）无干扰，在混合血清(TC 4.58 mmol/L、TG 1.25 mmol/L、HDL-C 1.35 mmol/L)中加入不同量的LDL后，TC含量＜7 mmol/L时基本不影响HDL-C结果，与李清华等^［4］评价日化试剂的结果基本一致，至TC总量9.51 mmol/L、LDL7.52 mmol/L时HDL-C可下降至29%，与日化试剂下降幅度一致。但在测定高TC血清(＞9 mmol/L)时，本法与PTA-Mg法结果一致，其原因可能是高浓度的LDL使液体本底浑浊而致测定结果偏低。

在测定两组不同TG浓度的血清时，本法与PTA-Mg法的比较中显示低TG正常组(平均1.23 mmol/L)本法与PTA-Mg法相关好；而在高TG组(平均2.84 mmol/L)，本法离散度大，存在较高的系统偏差，在日化直接法测定时同样有此现象^［5，6］。高TG血清在沉淀法中可因apo B沉淀不完全而影响结果，而用直接法测定时基于其测定原理，加入RⅠ试剂后使LDL、VLDL逐步形成稳定复合物，其浊度与复合物浓度成正比，因此在高CM、TG、LDL的情况下，大大增加溶液的浊度，在520 nm时浊度影响较大。鉴于这种现象，显然直接法不适于单波长测定，即使用双波长测定，最适波长的选择也受到血清高脂蛋白含量及不同色原的限制。本法选用了中灵敏度的色原，在一定脂蛋白浓度范围内与PTA-Mg法相关良好，但是在特殊的情况下显现出波长的选择和色原的缺陷，建议TG大于6 mmol/L的标本用生理盐水稀释后测定。日化试剂的色原灵敏度高，其最大吸收峰在546 nm，其第一代产品选用546/600 nm，后来改为600/700 nm作为双波长来分析，推测很大程度上是为了减少高脂蛋白血清浊度的干扰。因此，在没有自动分析仪的实验室，若采用手工进行直接法测定时，一定要同时做样本的空白对照，尤其对于高TG的标本，手工法受到的影响更大，因此要尽可能地选用双波长进行检测。

关于HDL-C测定的准确性，除了试剂的特异性、抗干扰性能和合理的测定方法等因素外，校准血清的准确定值也极为重要。我们将新鲜混合的冰冻血清及冻干人、牛混合血清经-20℃稳定1个月后，用DS-Mg法、PTA-Mg法及本法测定，两种校准血清的结果呈现一致性，从血清及HDL纯品的剂量响应曲线的截距上分析，仍然不排除存在基质效应，我们发现冰冻血清曲线的截距稍大。今后随着我国HDL-C直接法的普及，校准血清的制备及定值是一个严重的问题，仍需要广大同道共同协作完成。

本室研制的试剂性能指标符合临床要求，可与国外目前的同类试剂相媲美，填补了国内的相应空白，但研制工作尚处初期，在今后的实践中应随时解决出现的问题，使之逐步完善。

志谢：承蒙李健斋教授悉心指导

1 中华医学会检验学会血脂测定推荐方法四、血清高密度脂蛋白胆固醇测定方法(草案).中华医学检验杂志,1995,18:311-312.

2 高德路，谢声扬，李紫阳，等.硫酸葡聚糖500-镁法测定血清高密度脂蛋白胆固醇.中华医学检验杂志,1996,19:22-24.

3 Warnick GR, Wood PD. National cholesterol Education Program Recommendations for Measurement of High-density Lipoprotein cholesterol Executive Summary. Clin Chem.1995,41:1427-1433.

4 李清华，杨昌国，贺娟，等.对高密度脂蛋白胆固醇直接测定法的评价.临床检验杂志，1998，16：269-273.

5 高德路，张世俊，国汉邦，等.高密度脂蛋白胆固醇直接测定法与硫酸葡聚糖50-镁法比较.中华医学检验杂志，1998，21：23-26.

6 Harris N, Galpchian V,Thomas J, et al. Three generations of high-density lipoprotein cholesterol assays compared with Ultracentrifugation/dextran sulfate-Mg²⁺ method. Clin Chem,1997,43:816-823.