标本中的葡萄糖在ATP的存在下，由己糖激酶的作用生成6-磷酸葡萄糖（G-6-P），G-6-P又在6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G-6-PDH）的作用下，并且在氧化型（NADP）的存在下，转变成6-磷酸葡萄糖酸，此时在波长330~350nm（或采用主波长330~350nm，副波长405~800nm的双波长测定法）下测定生成的还原型（NADPH）的增加量，求出葡萄糖浓度。
[参考值]
血清：3.3~5.6 mmol/L（60~100 mg/dL）
与常用的葡萄糖氧化酶法（GOD法）比较，其优越性主要表现在：
- 葡萄糖氧化酶法（SOD法）特异性催化β-D-葡萄糖。而葡萄糖α和β构型各占36%和64%，要使葡萄糖完全反应，必须使α-葡萄糖变旋为β-构型。国外某些商品试剂中含有变旋酶，可加速变旋过程。也可通过延长孵育时间，自发性变旋完成转化。结果的准确性必然受到影响。
- SOD法中，第二步过氧化物酶反应特异性低，一些还原性物质，如尿酸、维生素C、胆红素、血红蛋白、四环素和谷胱甘肽等，可与色原性物质竞争H2O2 ，从而消耗反应过程中所产生的H2O2，产生竞争性抑制，使测定结果偏低。
- 己糖激酶法是目前国际上公认的测定葡萄糖参考方法，该法通常用终点法测定，反应迅速，适合于各种生化分析仪。
- 己糖激酶法基本不受溶血、脂血、黄疸、尿酸、维生素C及药物的干扰，其准确度和精密度相对较高。