速率法测定酶活性线性范围的分析与设定

实验技术

速率法测定酶活性线性范围的分析与设定
发布时间 2007/5/24 点击 4841 次

李浩，缪应业，秦晓燕 (中国人民解放军152医院检验科，河南平顶山467000)
关键词：速率法；线性范围
中图分类号：R446．11 2 文献标识码：A 文章编号：1671—7414(2003)02—032—01
酶法测定都有线性范围规定，如果标本酶活性过高，超过线性范围，则需要对标本稀释重做，然后乘以稀释倍数。我们在实践操作中发现，有些标本虽然超过线性范围，但反应进程曲线显示仪器仍能对其准确测定，而不需要对标本进行稀释重做。Olympus AU640大型生化分析仪就具有对异常标本自动重做功能，如对酶活性超出线性范围的标本自动稀释重做，方便快捷。若根据仪器实际参数设定线性范围，不仅节省试剂，而且可以提高工作效率。
正确评价和设定线性范围是自动稀释重做功能的关键，如果设置不当，不但浪费试剂，还会影响仪器速度。现就ANDOX英国ALT 双试剂试剂盒(批号5361H)线性范围设定为例介绍如下。
1 线性参数分析 ALT 试剂盒设定线性范围为400 U／L，为了分析其线性范围，首先需要了解限额参数MIN·A／MAX-A，根据文献[石寅皓．全自动生化分析仪限额参数的设置[J]．临床检验杂志，1998；16(2)：96]，选择一份高活力ALT样品(760U／L左右)。在Olympus AU 640分析仪按说明书设置参数，方法：RATE；波长340 nm／380 nm；样品15 l；第一试剂150 l；第二试剂3O l(试剂加入时间固定，第二试剂在第1O、ll点之间)；仪器读取吸光度时间：共读27点(其中0到1点之间为27 s，其余各点间为18s)。空白读取时间：0n 10点；延迟时间：11～ 15点；测定读数时间：15～ 25点(180 s)；系数：2 063。测定标本得图1反应进程曲线。横坐标为反应时间点，纵坐标为吸光度A。对照反应进程曲线，吸光度在o．430 o以下时，曲线呈非线性，因此该试剂盒MAX-A 设为0．450 0，MAX-A 根据实际测定设为1．300。通过以上数据，我们可推算该试剂盒的线性范围，假设标本浓度足够高，在第25测试点以后，底物消耗较多，反应不再是零级反应，反应曲线呈非线性。则该标本在11～25测试点吸光度变化量为0．85A(1．3A～0．45A)，由于ALT 活力是通过NADH 的变化量进行测量，NADH 的毫摩尔吸光系数为6．3，因此NADH 的转换量为0．13 mmol／L(0．85÷6．3)，则每分钟的变化量为0．031 mmol／L(O．13÷14÷18X 60)，14为测试点数，18为每两个测试点之间的时间，6O为60 S。则该标本的ALT大约为403 U／L，即为0．403 mmol／L(0．031× 13)，13为标本稀释倍数。由此可见理论推算结果与说明书线性范围基本一致。

2 线性范围具体设定许多生化分析仪都具有是否使用延迟时间功能，即N0 LAG TIME YES OR NO，如0LYMPUS AU 640设定NO LAG T1ME YES后，如果遇到高酶活性的标本后，仪器根据情况，可以不要延迟时间，直接从第ll～21点进行测定，此时NADH 的每分钟变化为0．043 mmol／L(O．13÷ 10÷18X 60)，标本的活性为559U／L，即0．559 mmol／L(O．043X13)。因此，该试剂盒线性范围在OLYMPUS AU 640最小可以设定为560 U／L。因为增大样本试剂比例、减少测试点数目等都可以成倍扩大线性范围，但不能无限扩大，因为以上措施在扩大线性范围的同时，也增大了系统误差和偶然误差对测定的影响。
由于该试剂盒R1试剂不含NADH，内源性酮酸与乳酸等引起的吸光度下降主要在延迟时间内消除，如果不要延迟时间，结果可能偏高，因此对于ALT 测定，R1试剂最好同时含有NADH 和LDH，在第一步反应中消除内源性酮酸与乳酸的干扰
[来源：来宝网]

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