来宝网 2025/9/17点击87次
蛋白质组学定量方法包括相对定量和绝对定量两部分：相对定量蛋白质组学（也称比较蛋白质组学）是指对不同生理病理状态下细胞、组织或体液蛋白质表达量的相对变化进行比较分析；绝对定量蛋白质组学是测定细胞、组织或体液蛋白质组中每种蛋白质的绝对量或浓度。
绝对定量对于临床疾病的诊断和治疗具有明显的现实意义。蛋白质生物标记量的变化，可以直接反映疾病的发展状况，因此通过对疾病不同时期的生物标记物绝对定量的检测，可以直观地判断疾病的发展情况。在很长一段时间内，对蛋白质进行绝对定量主要通过免疫学方法来实现，例如酶联免疫吸附测定（ELISA），然而这种方法1次只能定量1个蛋白，且抗体种类有限，不是每个蛋白都能进行定量。随着质谱技术的发展，基于质谱的蛋白质绝对定量方法开始广泛地应用于蛋白质组的绝对定量分析。根据有无标记，可将蛋白质组学绝对定量分析方法分为以下两种：
1、基于内标法的蛋白质组绝对定量
1.1同位素标记的肽段作为内标的蛋白质组绝对定量
在定量蛋白质的过程中，从氨基酸序列中筛选出相对分子质量大小适中（约0.9～2ku）、质谱信号强的肽段作为模板，用化学合成或细胞培养的方法合成带有一定同位素（如13C、15N、2H）标记的相同肽段作为内标，通过检测肽段的质谱信号强度之比（峰高或峰面积比）来对相应蛋白质进行绝对定量。
1.2同位素标记的氨基酸作为内标的蛋白质组绝对定量
在强酸环境下，将待测蛋白质完全水解为氨基酸混合物。随后，添加已知量的同位素标记氨基酸作为内标。通过MALDI-TOF-MS质谱技术，检测并比较氨基酸与内标的质谱峰强度，从而确定氨基酸的浓度。最后，根据该氨基酸在蛋白质中的占比，推算出蛋白质的绝对含量。
1.3基于同位素标签标记的肽段用于蛋白质组绝对定量
将一对同位素标签分别结合至待测样品肽段与合成的相同氨基酸序列肽段上，形成了物理化学性质相同而相对分子量不同的同位素标签化合物标记的一对肽段，经质谱检测即可测定样品中的蛋白或肽段的绝对量。
1.4基于电感耦合等离子体质谱测定元素的蛋白质组绝对定量
在酶切后的磷酸化肽段混合物中加入一适当的磷酸化合物BNPP作为内标，经HPLC分离后，在ICP-MS 中检测磷元素的质谱峰强度，同时在同样的色谱条件下用 ESI-MS进行定性鉴定肽段的氨基酸序列，通过内标的峰强度和已知的加入量，以及每个肽段含磷酸残基的个数，就可以计算出含磷酸肽段的绝对量。
2、无标记的蛋白质组绝对定量
蛋白质的量是与其酶解产生的肽段在质谱中的信号呈正相关的，通过往待测样品中加入已知量的某个标准蛋白（非待测蛋白），然后比较加入的标准蛋白的肽段与待测样品中蛋白的肽段在质谱中的信号强度，最后再结合加入的标准蛋白的量就可以计算出待测样品中蛋白的绝对含量。
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