来宝网 2025/6/15点击203次
据估计，约有1/3的蛋白质可在生物体内任何时间发生磷酸化。对磷酸化蛋白的鉴定与蛋白磷酸化动态的了解，包括某个氨基酸残基在响应细胞与环境因子时发生磷酸化或去磷酸化，均有助于在整体水平上研究生物网络的调控。由此出现的这一系统生物学新领域被称为磷酸化蛋白质学。而对生物系统中全部磷酸化蛋白质的综合分析，包括所有磷酸化蛋白质的鉴定、磷酸化位点的精确定位及差异表达磷酸化蛋白质的定量，被称为磷酸化蛋白质组学。对磷酸化蛋白组学进行定量分析，有助于我们深入理解细胞信号传导机制，发现疾病生物标志物，推动药物研发，实现精准治疗。目前，已经建立了多种方法来量化蛋白质磷酸化的变化，常见的方法有以下几种：
1.1.稳定同位素标记标记技术
1.1同位素代谢标记技术
15N标记：将细胞在两种培养基中分别培养，其中一种培养基的N源由15N提供。随后将两种培养基中的细胞混合并提取分离目标蛋白质，酶解，最后用质谱分析肽段。谱峰14N/15N同位素丰度比可以体现出两种来源蛋白质表达量的相对水平，根据其比值来进行磷酸化程度的相对定量。
特点：该方法非常适用于追踪单个磷酸化位点的动力学变化，但它仅限于分析那些表达水平相对较高的蛋白质。且目标蛋白质需要分离纯化，不适用于大规模的蛋白质定量分析。
SILAC标记：SILAC技术出现以后，很快取代了15N标记法。该技术采用含有轻同位素型和重同位素型氨基酸的培养液对不同细胞分别进行培养，使细胞内的蛋白被同位素稳定标记。提取细胞蛋白并将其等量混合，酶切后进行质谱鉴定，通过分析不同标记型肽段的相对量而确定蛋白的相对量。此外，可用于肽段定量研究的iTRAQ、iCAT 等技术同样可用于磷酸化肽段的研究。
特点：该技术具有蛋白质损失小、标记效率高，误差低、可以实现多种的样本比较、肽段覆盖率高等特优点，但此方法只能用于体外培养的细胞标记，且成本较高。
18O标记：其原理是将蛋白质酶切时或酶切后放入H218O 中，在蛋白酶催化作用下将羧基上的2个O替换成 18O ，除了C端肽之外，在适宜的条件下，所有的肽段一般都可以替换上2个18O，使肽段质量数相差+4 u。
特点：常产生标记一个氧原子和两个氧原子不等的现象，离子色谱面积（EIC）分辨率低且有重叠峰出现。
1.2化学标记技术
磷酸肽同位素亲和标签法（PhIAT）：近年来，同位素标记的亲和标签（ICAT）技术被广泛用来对蛋白质表达水平进行定量，并进一步扩展到对磷酸化水平进行定量。其基本原理是使磷酸化肽段的磷酸基团在碱性环境下发生β消除形成双键，同时用标有不同同位素的亲核试剂与双键发生加成反应取代磷酸基团。
特点：适用于对含有磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸残基的肽进行定量的方法。但化学反应效率一般较低，且磷酸化也只发生在全蛋白质中的一小部分，在对全蛋白质的磷酸化定量分析中存在一定难度。
2.亲和色谱结合同位素标记法
对两个样本分别采用不同的甲酯化试剂 （甲醇和氘代甲醇），用亲和色谱将磷酸肽富集后进行LC-MS分析，通过分析成对磷酸肽的丰度比进行磷酸肽的定量研究。
特点：该技术对成对的磷酸肽确认比较困难，需要专门的软件分析。因为成对磷酸肽的质量数差值并不一致，与该肽段中可甲酯化的残基数目有关。同时还有部分谷氨酰胺残基发生脱氨基反应转变为谷氨酸也被甲酯化，增加了分析的难度。
3.Pro-Q Diamond磷蛋白染色
其原理是利用特定的荧光染料与磷酸化蛋白质中的磷酸基团发生反应，从而实现对磷酸化蛋白质的染色。然后通过荧光扫描仪检测凝胶上的荧光信号，实现对磷酸化蛋白质的定量检测。该过程可直接在聚丙烯酰胺—十二烷基硫酸钠（SDS-PAGE）凝胶和二维凝胶（2D-PAGE）上进行。
特点：该技术尤其适于检测蛋白激酶和磷酸酶亚基。该法染色步骤快速、简便、可逆、易于操作，能与多种蛋白质组学方法兼容。缺点是存在非特异性染色，荧光信号易受多种因素影响。
图1 定量磷酸化蛋白组学分析流程
百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Q ExactiveHF质谱平台，Orbitrap Fusion质谱平台，Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，推出磷酸化定量蛋白组分析服务技术包裹。只需要将您的实验目的告诉我们并寄送样品，百泰派克生物科技负责项目后续，包括蛋白提取、蛋白酶切、磷酸化肽段富集、肽段分离、质谱分析、质谱原始数据分析、生物信息学分析所有事宜。
