来宝网 2025/6/2点击140次
蛋白质磷酸化是由蛋白激酶和磷酸酶催化的一种翻译后修饰，在许多细胞过程中发挥重要作用，如：
1、调节蛋白稳定性：通过改变蛋白质的降解速率来调控其稳定性。
2、介导蛋白活性：通过改变蛋白质的构象，从而激活或抑制其活性。
3、参与细胞介导：通过磷酸化，细胞可以对外界刺激作出响应，调节细胞的生长、分化、凋亡等过程。
4、调控细胞生理功能：包括代谢、转录、翻译调节、蛋白降解、细胞动态平衡、细胞增殖、细胞分化以及细胞存活。
图1 蛋白质磷酸化的功能
质谱是近年来生物学研究中一种常见的分析技术，运用质谱可以测定蛋白质的一级结构，包括分子量、肽链氨基酸排序及二硫键数目及其位置，是一种可发现和鉴别翻译后修饰的方法。运用质谱技术检测蛋白质磷酸化的步骤包括：①磷酸化肽的富集；②磷酸化肽的检测与磷酸化位点的确定；③蛋白质磷酸化的定量研究；④生物质谱数据分析。
1、磷酸化肽的富集：
蛋白质组中只有一小部分蛋白质发生磷酸化。磷酸化肽在蛋白质水解产物中常表现为低丰度，质谱对磷酸化肽的响应常会被高丰度的非磷酸化肽所干扰。所以当所得到的蛋白质含量极为有限时，用质谱技术分析磷酸化肽前需要将一些非磷酸化肽的含量降低（或富集磷酸化的肽）。常用的富集方法有免疫共沉淀和固相金属亲和色谱技术(IMAC)。
2、磷酸化肽的检测与磷酸化位点的确定：
样品制备完成后，需要对磷酸化肽进行检测，并进一步确定蛋白质的磷酸化位点。一般使用基于MALDI-TOF MS的肽指纹谱（PMF）鉴定与磷酸酯酶处理相结合来确定磷酸化位点。用磷酸酯酶处理磷酸化的肽后，肽段的质荷比会产生特定数量的变化，通过MALDI-TOF MS检
测这种质荷比的变化可以确定磷酸化位点。
3、蛋白质磷酸化的定量研究
蛋白质磷酸化残基的识别仅是基于磷酸化变化理解信号转导的第一步。需要量化对特异性刺激反应的蛋白质磷酸化的变化，以此来描述蛋白质特定残基的磷酸化与其如何影响蛋白质功能之间的关系。基于质谱技术的蛋白质组学的定量方法可分为标记定量和非标记定量两大类。常用于蛋白质磷酸化定量研究的方法主要是稳定同位素标记（SILAC）和金属元素标记法等标记定量法。此外，iTRAQ、iCAT 等技术同样可用于磷酸化肽段的定量研究。
4、生物质谱数据分析
质谱得到的数据经过数据库检索才能得到解析，数据库是质谱数据库检索法分析的重要保障。对于模式生物和已知蛋白序列较多的的物种，质谱数据分析通常会简单一些，得到的结果可靠且成功率高。如果所研究物种已知蛋白序列较少或者不完整，通常采用跨物种检索的办法检索近缘物种数据库，这种方法鉴定效率低且准确度差。SwissProt、TrEMBL 是常见和重要的蛋白质数据库，收录有目前所有已知蛋白的具体信息。此外，还有NCBInr，Mascot等数据库。
图2基于质谱法的蛋白质磷酸化分析步骤
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