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实验操作 | 滴滴! 解锁 T 细胞活化 — 诱导实验秘籍

来宝网 2025/8/28点击318次

T 细胞在机体防御体系中扮演着不可或缺的角色，它不仅是清除病原体的"主力军"，还是维持免疫记忆的"守护者"，保护机体免受再次侵害！在体外实验中诱导 T 细胞对免疫反应，尤其是 CAR-T 疗法的深入研究意义重大......
Section.01
T 细胞激活的机制

T 细胞的活化需要两种信号的共同参与。

第一信号是 TCR-CD3 的复合物，其传导的强度和持续时间决定了 T 细胞的激活程度，其中 TCR 特异性地识别抗原肽-MHC 复合物，CD3 将识别的信号传递到细胞内部。研究表明，通过调节 CD3 的信号传导，可以增强或抑制 T 细胞的免疫反应。例如，CD3 抗体 (如 OKT3) 能够识别 TCR-CD3 复合体上 CD3 分子的 ε 链，模拟抗原-MHC 的作用，直接激活 T 细胞，调节 T 细胞的增殖[1][2]。

T 细胞激活还需要第二信号，即共刺激信号。最常见的共刺激分子是 CD28，它可以和树突状细胞表面的 B7 分子结合，共同促进 T 细胞的激活过程，并且增强 T 细胞的增殖和分化。CD28 抗体可以通过不同的机制激活或抑制 T 细胞活性，为免疫调节提供了重要工具[3]。

在这场 "免疫交响曲" 中，树突状细胞不仅是抗原呈递的 "指挥官"，还是细胞因子的 "生产者"。树突状细胞可以分泌细胞因子，如 IL-2、IL-12，进一步诱导 T 细胞的增殖，诱导 CD4+ T 细胞分化，增加 CD8+ T 细胞的细胞毒性，支持免疫记忆细胞的形成。

画板 98.png

图 1. T 细胞激活的主要信号[4]。

信号 1：TCR 与 CD3 结合，传递 pMHC 信号；信号 2：共刺激信号 CD28 与 B7 分子（CD80/86）结合，促进 T 细胞的增殖和激活；信号 3：细胞因子，如 IL-2 和 IL-12，调节 T 细胞的增殖和分化。

当 T 细胞被激活后，它们会退出静止状态，进入快速的克隆扩增阶段。被激活的 T 细胞会多次分裂，产生大量具有相同 TCR 的子代细胞。这些子代细胞将进一步分化为效应 T 细胞和记忆 T 细胞。效应 T 细胞如 CD4+ T 细胞分化为 Th1、Th2、Th17 等亚群，承担独特的免疫调节功能；CD8+ T 细胞则分化为细胞毒性 T 细胞，直接杀死靶细胞。另一部分子代细胞会分化为记忆 T 细胞，在后续的病原体再感染中提供快速且有效的免疫反应[2]。

Section.02
诱导 T 细胞活化的方法

T 细胞激活也可以通过化学途径或抗体途径实现。使用 CD3/CD28 抗体激活 T 细胞可以模拟体内自然的免疫反应，适合研究抗原特异性 T 细胞反应。通过 PMA/Ionomycin 化学途径能够快速诱导 T 细胞激活，但是可能对细胞产生非特异性毒性。

抗 CD3ε 抗体能够特异性结合 CD3ε 链，模拟抗原呈递细胞 (APC) 与 TCR 的相互作用，激活 T 细胞。抗 CD28 抗体可以分为超激动型、常规抗型、调节型以及单价抗 CD28 抗体。

  • 常规型抗 CD28 抗体 (如 37.51) 可以结合 CD28 的其他表位，部分阻断 CD28/B7 的相互作用，与 TCR 信号协同作用来共刺激 T 细胞。

  • 超激动型抗 CD28 抗体 (如 D665) 结合 CD28 的侧向暴露的 C''D 环，能够多聚化 CD28 分子而不阻断 CD28/B7 的相互作用，且不依赖于 TCR 信号通路地激活 T 细胞。
  • 调节型抗 CD28 抗体 (如 JJ319) 可以下调 CD28 的表达来调节 T 细胞的活化，它们能够在体外共刺激 T 细胞，在体内通过下调 CD28 表达来抑制 T 细胞的活化。

  • 而单价抗 CD28 抗体可以结合 CD28 的单个表位，阻断 CD28/B7 的相互作用，但不通过多聚化 CD28 分子来激活 T 细胞，在体外和体内表现出拮抗作用，抑制 T 细胞的激活[2][3]。

PMA 可以模拟细胞内信号分子 DAG，直接激活蛋白激酶 PKC，绕过 TCR 激活的早期步骤，直接触发下游信号通路。Lonomycin 是一种钙离子载体，能够选择性地结合钙离子并增加细胞质内的钙离子浓度，模拟 IP3 的作用，激活钙调蛋白 CaM 和钙调磷酸酶 CaN，激活 NFAT 并促进细胞因子的表达。PMA 和 Ionomycin 的联合作用可以促进 T 细胞活化[5]。

图 2. PMA/Ionomycin 诱导 T 细胞活化的通路。

PMA 激活 PKC 和 Ras 信号通路，Ionomycin 诱导细胞质内钙离子含量升高，两者通过协同作用激活 AKT 信号通路，非 TCR 依赖性地诱导 T 细胞激活。

表 1. PMA/Ionomycin 和 CD3/CD28 抗体激活 T 细胞的作用机制和激活效果的比较[5]。

CD3/CD28 抗体诱导 T 细胞活化[5]:

1. 细胞提取

(1) 使用 C57BL/6 小鼠的脾脏作为细胞来源，将其研磨为单细胞悬液，用滤网过滤去除组织碎片。
(2) 使用红细胞裂解液裂解红细胞，获得富集的白细胞并重悬。

2. 细胞分选

(1) 选择合适的小鼠 CD3/CD8 细胞分选试剂盒，按照试剂盒说明书标记小鼠的 CD3+ 和 CD8+ T 细胞，并通过磁性分离珠分离目标细胞。
(2) 可用流式细胞术鉴定分选后的细胞，确保细胞纯度在 95% 以上。

3. 细胞培养

分选后的 T 细胞在 37 ℃、5% CO2 的条件下，培养在含有 2 mM Glutamine，10% FBS 和 penicillin-streptomycin 的完全培养基 RPMI 1640 中。

4. 抗 CD3ε 抗体和抗 CD28 抗体刺激活化

(1) 在 96 孔板中预先包被抗 CD3ε 抗体 (如 145-2C11) 和抗 CD28 抗体 (如 PV-1)，浓度分别为 3 µg/mL 和 1 µg/mL。
(2) 分选后的 T 细胞以 1×105 细胞/孔的密度接种于 96 孔板中，每孔  200 μL 完全培养基。
(3) 将分选后的 T 细胞与包被好的抗体在 37 ℃、5% CO2 的条件下共孵育 24 小时。
收集细胞并用 PBS 洗涤。
通过流式细胞术对 T 细胞活化进行检测。

PMA/Ionomycin 诱导 T 细胞活化[5]:

细胞提取、分选和培养的具体步骤如上文 CD3/CD28 抗体诱导 T 细胞活化 1-3 所示。

4. PMA/Ionomycin 刺激活化
(1) 分选后的 T 细胞以 2×105 细胞/孔的密度接种于 96 孔板中，每孔  200 μL 完全培养基。
(2) 分别向培养基中加入 50 ng/mL、100 ng/mL 和 500 ng/mL 的 PMA，和 100 ng/mL Ionomycin。
(3) 设置空白对照组，仅加入完全培养基而不添加 PMA/Ionomycin。
(4) 细胞在 PMA/Ionomycin 刺激下在 37 ℃、5% CO2 的条件下培养 24 小时。
(5) 收集细胞并用 PBS 洗涤。

(6) 使用固定活性染料标记死细胞，通过流式细胞术对 T 细胞活化进行检测。

注意事项[5][6]：

1. T 细胞活化实验通常使用小鼠脾脏 T 细胞、淋巴结细胞或人外周血单个核细胞 (PBMC)。PBMC 分离纯化的详细步骤可参考：公众号推文链接 (诱导巨噬细胞活化)
2. 红细胞裂解步骤可根据所用裂解液的不同调整用量及时间。
3. 细胞分选后，确保目的细胞的纯度在 95% 以上，避免非目的细胞造成干扰。
4. 细胞孵育过程中可加入 IL-2，以确保 T 细胞的存活。短期培养 (<7 天) 时可以不添加外源性 IL-2。
5. 在抗体刺激法中可以使用抗 CD3/CD28 磁珠替代 CD3 抗体和 CD28 抗体。按照 1:1 的比例混合磁珠和细胞混合液。诱导完成后使用磁力架去除磁珠。

6. 以上步骤是基于文献整理的实验方法，实际操作建议根据具体的实验室条件和实验需要适当调整。

T 细胞活化的鉴定[1][7][8]

T 细胞活化在早期 (通常为激活的第一个 24 小时) 的表现为 CD25、CD38、CD69、CD154、HLA-DR 和 ICOS 表达的上调，和 CD127 表达的下调。
长时间的持续刺激导致 T 细胞进入功能耗竭状态 (通常为激活的 96 小时)，PD-1、CTLA-4 和 TIM-3 表达提高，细胞因子如 IL-2、IFN-γ 和 TNF-α 的分泌减少。这些蛋白是 T 细胞耗竭的标志物，是细胞程序性死亡蛋白或具有抑制 T 细胞活化和增殖的作用。

图 3. T 细胞活化导致细胞表面标志蛋白的变化[9]。

髓系白血病细胞通过共刺激分子诱导 T 细胞激活，但长时间的刺激最终导致 T 细胞功能耗竭。这种耗竭状态通过抑制性受体的上调和细胞因子分泌的减少来体现。T 细胞激活导致 CD25、CD69、ICOS 和 CTLA-4 表达升高，CD127 表达降低；T 细胞耗竭时 CD127 和 CD69 表达减少，PD-1、TIM-3 和 LAG3 表达提高。

T 细胞被激活后，可以增殖分化为效应 T 细胞 CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞。CD4+ T 细胞可以分化为多种亚型，如 Th1、Th2、Th17 和 Tfh 细胞等，它们分泌细胞因子 IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ 和 TNF-α，参与免疫调节，同时辅助其他免疫细胞。CD8+ T 细胞通过释放具有细胞毒性的穿孔素 (perforin) 和颗粒酶 (granzymes) 直接杀死靶细胞。

通过流式细胞术和酶联免疫吸附试验 (ELISA)，可以定量检测上述蛋白和分泌因子的表达，从而监控 T 细胞活化的过程。

表 2. T 细胞激活后的 24 小时内，细胞表面标志物和分泌的细胞因子的表达量变化[7][8][9]。

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[1] Chi H, et al., Principles and therapeutic applications of adaptive immunity. Cell. 2024 Apr 25;187(9):2052-2078.
[2] Menon AP, et al., Modulating T Cell Responses by Targeting CD3. Cancers (Basel). 2023 Feb 13;15(4):1189.
[3] Poirier N, et al., CD28-specific immunomodulating antibodies: what can be learned from experimental models? Am J Transplant. 2012 Jul;12(7):1682-90.
[4] Wong W K, et al. Engineering advanced dynamic biomaterials to optimize adoptive T-cell immunotherapy[J]. Engineered Regeneration, 2021, 2: 70-81.
[5] Gao R, et al., Protein phosphatase 2A catalytic subunit β suppresses PMA/ionomycin-induced T-cell activation by negatively regulating PI3K/Akt signaling. FEBS J. 2022 Aug;289(15):4518-4535.
[6] Trickett A, et al., T cell stimulation and expansion using anti-CD3/CD28 beads. J Immunol Methods. 2003 Apr 1;275(1-2):251-5.
[7] De Biasi S, et al., Marked T cell activation, senescence, exhaustion and skewing towards TH17 in patients with COVID-19 pneumonia. Nat Commun. 2020 Jul 6;11(1):3434.
[8] Rha MS, et al., Activation or exhaustion of CD8+ T cells in patients with COVID-19. Cell Mol Immunol. 2021 Oct;18(10):2325-2333.
[9] Ozkazanc D, et al., Functional exhaustion of CD4+ T cells induced by co-stimulatory signals from myeloid leukaemia cells. Immunology. 2016 Dec;149(4):460-471.

 


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