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高血脂动物造模 So easy! 细胞外囊泡如何荧光成像？更有 PPARα 抑制剂 GW6471

来宝网 2025/6/27点击179次


 承蒙数十万科学家信赖， MCE 文献引用已高达 50,000+！ 本期内容来自 MCE 客户--广西大学的杨兴珍投稿，经本人同意后编辑发布。 亲爱的 MCE 科研伙伴，如果您有使用 MCE 产品的经验心得，欢迎文末扫码私信，投稿分享~ 

 

 

本期实操案例
(1) 高脂血症模型鼠的构建
(2) 小分子抑制剂探索高脂代谢机制的口服使用方案
(3) 荧光染料标记细胞外囊泡的活体示踪。
Section.01
客户投稿

【基本信息】

1. 论文标题

2. 第一作者：杨兴珍 （通讯作者：李一星 周磊）

3. 第一作者单位：广西大学

4. 发表时间：2025 年 4 月 7 日

5. 影响因子 (IF)：33.2 (2024 IF)

6. 文献引用 MCE 产品：

作者对肠道在代谢性功能障碍相关脂肪肝病 (MAFLD) 发生中的具体机制进行了全面研究。利用食蟹猴单细胞转录组，发现肠道肝白血病因子 (Hepatic leukemia factor, HLF) 是一个新的肠道脂质吸收调控基因，在自发性脂肪肝食蟹猴肠道中表达量均上调。

特异性敲除 HLF 可通过抑制过氧化物酶体增殖激活受体 α (PPARα) 并恢复肠道屏障来改善 MAFLD。机制研究表明，HLF/PPARα 轴调节肠道菌群衍生的细胞外囊泡 (fEV)；该囊泡通过肠肝循环抑制肝细胞铁死亡并减少肝脏脂肪变性。脂质组学和功能分析发现，结合胆汁酸牛磺鹅去氧胆酸 (TCDCA) 是 fEV 降脂作用的关键驱动因素。这些发现为 MAFLD 提供了新的治疗策略。

图 1. HLF/PPARα 轴通过源自肠道微生物的细胞外囊泡调节 MAFLD[1]。

文章亮点

  • 肠道特异性缺乏 HLF 可改善 MAFLD。
  • HLF 通过 PPARα 在脂肪代谢调节中发挥作用。
  • HLF/PPARα 轴调节肠道微生物群并影响肠道微生物衍生的 fEV 的组成。
  • TCDCA是 fEVs 改善 MAFLD 的关键调节因素。
Section.02
MCE 产品引用
引用产品 1：诱导疾病模型类
  • Tyloxapol (HY-B1068) 在本研究中用于构建高脂血症小鼠，探索脂肪酸摄取。

实验步骤

小鼠禁食 16 小时后，腹腔注射 Tyloxapol (500 mg/kg；HY-B1068)。
引用产品 2：活性小分子类
  • GW6471 (HY-15372) 在本研究中用于小鼠口服，探索抑制 PPARα 改善高脂代谢的机制。
     

实验步骤

1. 购买 6 周龄雄性 C57BL/6 小鼠，在 8 周龄时，将小鼠随机分为两组 (每组 6-8 只)：(1) 高脂饮食组 (HFD 组)，喂食高脂饮食 (HFD, 5.5 kcal/g) 并灌胃生理盐水；(2) HFD + GW6471 组，喂食高脂饮食并灌胃 GW6471 (10 mg/kg；HY-15372)。
2. 在高脂饮食喂养 4 周后，从 12 周龄开始，每隔一天通过口服 GW6471，持续 8 周。
3. 在整个实验过程中，小鼠可自由摄食和饮水，并维持在标准实验室条件下 (温度：25 ± 2°C，湿度：50 ± 5%，12 小时光照/黑暗循环)。
图 2. 小鼠实验设计示意图[1]。
引用产品 3：荧光染料类

在本期的客户文献中，作者同时用到了荧光染料 Sulfo-Cy7.5 NHS ester (HY-D1568) 和 BODIPY 581/591 C11 (HY-D1301)。

荧光染料 (Dyes) 是一种非特异性检测方法，能与 DNA 结合，通常用于实时荧光定量 PCR (qPCR) 中，能随着 DNA 扩增量增加而荧光强度增加，从而实现定量分析，检测范围广。它们不需要特殊的探针序列，通常是单分子或双分子。
 

实验步骤

1. 将 fEVs 与 Sulfo-Cy7.5 NHS ester (HY-D1568) 在室温下孵育 6 小时，随后使用 30 kDa 超滤管进行浓缩和纯化。
2. 将荧光标记的 fEVs (总蛋白 20 μg) 通过口服灌胃给予每只小鼠。在给药后 3、6、12 和 24 小时，使用 IVIS-MARS 系统进行体内成像。
3. 24 小时后，对小鼠实施安乐死，并对心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肠道进行成像。
 

实验结果

体内追踪显示 fEVs 在大约 6 小时内到达肝脏，24 小时后信号减弱 (图 5A)。组织成像显示 fEVs 在肝脏和肠道中积聚 (图 3)。
图 3. 荧光标记的 fEVs 在小鼠体内和组织中的示踪 (n=3)[1]。
 

实验步骤

1. 脂质过氧化荧光染色使用 BODIPY 581/591 C11 荧光探针 (HY-D1301) 进行。
2. 将 1 mg BODIPY 581/591 C11 溶解在 0.1983 mL DMSO 中以获得 10 mM BODIPY 581/591 C11。
3. 在无血清细胞培养中稀释储备液培养基取 10 μM BODIPY 581/591 C11 工作液。4. 首先细胞在 24 孔板中培养 24 h，之后，加药处理细胞 24 h。
5. 随后，用 PBS 清洗细胞，加入 1 mL BODIPY 581/591 C11 工作液，室温孵育 30 分钟。
6. 避光清洗细胞 3 次，通过酶标仪检测红色荧光 (还原型；Ex=581 nm, Em=591 nm)，与脂质结合后会产生绿色荧光 (氧化型；Ex=500 nm, Em=510 nm)。数据以红光强度/绿光强度比值表示。
 

实验结果

如下图，实验表明，TCDCA (fEVs 改善 MAFLD 的关键调节因子) 可降低氧化应激 (氧化应激可增加脂质过氧化产物和细胞因子的释放, 介导 NAFLD 的发生发展)。
图 4. HepG2 细胞中脂质过氧化的荧光图像及定量分析 (n =4)[1]。
数据统计
所有数据均以均值&plusmn;标准差 (SD) 表示。使用双向重复测量方差分析 (ANOVA) 比较两条曲线在多个时间点的趋势。Friedman 检验用于四组随时间重复测量的比较。两组之间的统计比较采用 Student's t 检验，而多组比较则使用单因素方差分析。所有分析在 GraphPad Prism 9.0 或 SPSS 26.0 进行。P 值 <0.05（*）或 <0.01（**）被认为具有统计学显著性。图中不同字母表示组间存在显著差异。 
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小结
 再次恭喜我们的客户成功发刊！该研究首次提出肠道特异性缺乏 HLF 改善 MAFLD，HLF/PPAR&alpha; 轴通过肠道微生物来源的 fEVs 调节肠肝循环和抑制肝细胞铁死亡，从而改善 MAFLD。结果显示，结合型胆汁酸 TCDCA 为 fEVs 降脂作用的关键分子。这些发现阐明了肠道 HLF 在调节 MAFLD 中的功能，并为治疗该疾病提供了新的途径。
如果您也有使用 MCE 产品的经验心得，欢迎文末扫码私信，投稿分享~ 
 

 

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[1] Yang X, Wang J, Qi X, Hou M, Liu M, Xiao Y, Liu S, Zhou J, Yu J, Wang Y, Chen G, Yu L, Batchuluun K, Batsaikhan B, Damba T, Liang Y, Liang X, Ma J, Liang Y, Li Y, Zhou L. HLF and PPAR&alpha; axis regulates metabolic-associated fatty liver disease through extracellular vesicles derived from the intestinal microbiota. Imeta. 2025 Apr 7;4(2):e70022.

 

 

 

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