来宝网 2014/3/19点击1964次
Jessalynn P. Wheaton，Erin E. Chambers和Kenneth J. Fountain
应用优势
■ 使用更快的孔内分析方式，更简洁的单步提取法进行DBS提取
■ 去除99.9%磷脂
■ 消除磷脂在LC色谱柱中的蓄积，提升方法稳定性
沃特世解决方案
Xevo® TQ-S MS系统
ACQUITY UPLC®BEH C18柱
Ostro™ 96孔样品制备板
引言
干血斑分析法（DBS）在医药行业正变得愈发重要。动物实验所带来的经济及伦理道德方面的问题，以及在运输以及储存生物样品时所产生的高额费用问题，都使得DBS分析法成为一种颇具吸引力的选择。DBS分析法可取得较高的分析物回收率。然而，该技术在去除内源性干扰方面收效甚微。以残余磷脂（PLs）为主的干扰物是生物分析中遇到的主要问题。而LC/MS/MS系统中PLs的蓄积，则是引发基质效应的主要原因。在所有其他问题之中，基质效应会以无可预测的方式影响质谱响应值，降低分析方法稳定性并增加其可变性。Ostro 96孔样品制备板则可消除99%以上的PLs残留。Ostro 96孔板可通过使用96孔制备板的形式进一步简化DBS萃取流程，同时提取分析物、去除磷脂、过滤干血斑纸片。DBS样品可在孔内萃取并稀释直接进样到LC/MS/MS系统中。该创新方法能够显著降低样品制备时间，并在萃取转化、干燥、复溶过程中避免潜在的分析物流失。在本应用纪要中，我们同时应用了传统方法和Ostro 96孔样品制备板方法，对含有利培酮、利培酮羟基化代谢物、9-OH利培酮及其内标氯氮平（图1）的全血样品进行了萃取。
实验部分
ACQUITY UPLC条件
色谱柱： ACQUITY UPLC BEH C18，2.1×50 mm，1.7 μm
流动相A： 0.1% NH4OH 水溶液
流动相B： 50/50 ACN/MeOH
流速： 0.6 mL/min
梯度：
时间 梯度模式 梯度线型
(min) %A %B
0.0 75 25 6
2.0 0.5 99.5 6
3.0 0.5 99.5 6
3.1 75 25 6
3.5 75 25 6
进样量： 40 μL
进样模式： 部分环进样
柱温： 35 ℃
样品温度： 15 ℃
强洗针液： 60:40 ACN:IPA＋2% HCOOH
弱洗针液： 95/5 H2O/MeOH
沃特世Xevo TQ-S MS运行条件，ESI+
毛细管电压： 3.0 V
脱溶剂温度： 550 ℃
锥孔气流速： 150 L/Hr
脱溶剂气流速： 1000 L/Hr
碰撞池压力： 2.6×10(-3) mbar
MRM通道监测，ESI+参见表1
样品制备条件
将20 μL的全血样品滴在未经处理的Whatman DMPK-C血卡上。样品随后在室温下干燥2小时。使用Harris 3 mm微打孔器取3 mm血斑，分别放置进传统型DBS萃取法所需的1.5 mL离心管和Ostro 96孔板孔中。传统萃取方法在1.5 mL离心管中进行，使用了250 μL含5%水的甲醇溶液，随后样品进行1分钟涡旋、1分钟3000 g离心，并最终将萃取物转移至96孔板上。使用Ostro 96孔板的萃取则采用单步孔内萃取法。在Ostro 96孔板中添加3 mm干血斑（图2）。以250 μL含5%水的甲醇溶液作为萃取溶液，涡旋操作1分钟、真空操作5分钟。两种方法产生的洗脱液都用250 μL 的水进行稀释，然后进样到LC/MS/MS系统中。
结果与讨论
在正离子模式下进行MS分析。鉴于DBS萃取物的直接进样通常会导致极稀释的样品，我们采用Xevo TQ-S以显著提升系统的灵敏度。这同时也有助于直接进样，并避免了吹干、复溶过程中可能存在的问题。
针对每一种样品制备方法，我们都比较了磷脂残留量。为了达成这一目的，我们对单个试管萃取和使用Ostro PLR板孔内萃取的DBS进行了比对，对五种磷脂进行了量化。与传统型DBS分析法相比，Ostro板去除磷脂比例高达99.9%（图3）。为能直观展示残余磷脂，传统型DBS萃取法和使用Ostro的孔内DBS萃取法所产生的五种不同磷脂的总离子流（TIC）如图所示（图4）。当使用Ostro板时，磷脂残留量几乎可忽略不计，且无蓄积情况。而当使用传统型DBS法时，即便出于预防磷脂蓄积的目的，采用高比例有机溶剂进行了1分钟的清洗，磷脂残余量依旧显著，而且在整个过程中都有蓄积。我们进行了半验证，计算QC样品浓度不足预期值的15%，满足法规标准。9-OH利培酮（图6）及其母化合物LLOQ在全血中都达到 0.05 ng/mL。标准曲线在3个以上数量级呈线性，全血中的线性范围从0.05 ng/mL到50 ng/mL（图7）。
结论
■ 简便、单步的DBS样品制备方法
■ 相较于传统的DBS萃取技术，去除残余磷脂含量高达99.9%
■ 采用Xevo TQ-S质谱仪，获得高灵敏度
■ 去除LC色谱柱中PLs的蓄积
