来宝网 2013/12/24点击1030次
Keith Richardson1 , Christopher J. Hughes1 , Arkadiusz Grzyb1 , Dominic Helm2 , Bernhard Kuster2 , Jason Wildgoose1
1沃特世公司 （英国曼彻斯特）
2慕尼黑理工大学 （德国弗赖辛）
应用优势
■ 改善蛋白质识别，增加蛋白质组覆盖范围
■ 即使在极低浓度下也能实现可靠鉴定
■ 更有效地进行LC/MS/MS分析从而加快决策过程
简介
随着自下而上（bottom-up）蛋白质组学分析的复杂性不断增加，对于质谱仪的能力提出了挑战，其需要生成更多的详细信息才能满足用户的需要。近年来，质谱仪的速度、灵敏度和质量数准确性都有了显著的提高，可获得更好的数据质量、改善的肽序列标注以及更准确的鉴定结果。
随着硬件性能的改善，我们开发出一系列新型LC/MS采集方案和碎裂机制，包括母离子发现（PID）方法、非信息依赖型采集（DIA）、离子淌度（IM）辅助方法以及电子转移解离（ETD）。目前，IM主要应用于多种类型分析物的截面分析和结构分析1，可增强DIA采集的特异性，例如HDMSE。2
本研究中展示了一种新型的高清晰数据采集 （HD-DDA）模式在蛋白质和肽鉴定中的应用优势，该模式将离子淌度法结合到四极杆飞行时间质谱仪中。HD-DDA采用一种高工作周期模式，有利于决策的制定，可实现高灵敏度和选择性的实验。
实验
使用胰蛋白酶酶切大肠杆菌和海拉细胞的胞质内容物。将溶解产物注入nanoACQUITY UPLC系统中，该系统配有ACQUITY UPLC BEH 1.7 μm，15 cm × 75 μm色谱柱并连接SYNAPT G2-Si质谱仪。采用ProteinLynx Global SERVER和/或Mascot对数据进行处理和搜索3。
结果与讨论
HD-DDA的改进包括全面支持宽带增强4，这可使信号提高5至10倍，并增强了决策制定逻辑，还可在MS和MS/MS模式之间切换。宽带增强利用离子淌度分离单电荷态的产物离子，并结合推斥极同步以实现接近100%的工作周期，如图1所示。
HD-DDA采集通常在非靶向模式下进行，可以由无限制的目标和/或排除列表进行补充。碰撞能量可以是阶梯式的、倾斜的或基于m/z和电荷态实时确定。数据可通过ProteinLynx Global SERVER或分别使用供应商中立的搜索算法和验证工具进行处理和搜索，例如Mascot和Scaffold5。
图2中证实了宽带增强的优势。其中，大肠杆菌胰蛋白酶消化物通过纳升LC/MS/MC进行分析。数据采集分别采用常规DDA和HD-DDA。在这两种情况下，均选取了LC峰内相同时间的0.1秒MS/MS数据。在该实验中，将整个MS/MS谱图进行平均后发现，信号增强了5倍。
在该实验中，每次调查扫描执行15次并行MS/MS实验。如图3所示，结果表明将DDA与HD-DDA对比时，MS/MS总离子流（TIC）的增加与MS/MS通道数呈函数关系。每次运行的平均增加量为420%，与图2中所示结果一致。插图是15次MS/MS通道的示例，证明了可从样品中存在的较低丰度的肽中轻松获取具有良好信噪比的MS/MS数据。
图4中显示了采用HD-DDA对相同的大肠杆菌样品进行自下而上的LC/MS蛋白质组学实验可增加灵敏度。A图展示了肽序列匹配数量的增加。B图中的维恩相交图将蛋白质鉴定数量进行了对比。从中可观察到鉴定的肽数量（34.8%）和蛋白质数量（42.8%）均有显著增加。
图5显示了一个更具挑战性的样品的搜索结果。此处汇总了海拉细胞胰蛋白酶消化物分析的PLGS搜索结果。总共有2200多种蛋白质被鉴定为超过95%的鉴定置信度阈值。在该实验中，谱图鉴定率为38%。
结论
■ HD-DDA宽带增强通常可使信号增强5至10倍
■ 低丰度物质/肽的谱图数据质量得到显著提升
■ MS/MS谱图获得正确匹配的比例大大增加
■ HD-DDA数据的鉴定数量增加是灵敏度提高和谱图质量改善的直接结果
参考文献
1. Giles K. Travelling wave ion mobility. Int J Ion Mobility Spectrom.
2013; 16(1):1-3.
2. Rodriguez-Suarez E, Hughes C, Gethings L, Giles K, Wildgoose
J, Stapels M, Fadgen K, Geromanos SJ, Vissers JPC, Elortza F,
Langridge JI. An Ion Mobility Assisted Data Independent LC-MS
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3. Perkins DN, Pappin DJ, Creasy DM, Cottrell JS. Probability-based
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4. Wildgoose, et. al. A comparison of methods of improving the duty
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4. Searle BC. Scaffold: a bioinformatic tool for validating MS/MS-based
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