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使用表面带电杂化(CSH)C18色谱柱提高反相肽分离的峰容量

来宝网 2013/6/14点击2088次



使用表面带电杂化(CSH)C18色谱柱提高反相肽分离的峰容量
Matthew A. Lauber, Stephan M. Koza, 和 Kenneth J. Fountain
沃特世公司(美国马萨诸塞州米尔福德)
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应用优势
反相肽分离的峰容量更高
与甲酸流动相兼容
有应用于UPLC®和HPLC的两种颗粒
CSH130 C18 使用细胞色素c 的胰蛋白
酶消化液进行QC检验
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沃特世解决方案
ACQUITY UPLC® H-Class Bio系统
Xevo® G2 QTof质谱仪
ACQUITY UPLC CSH130 C18，1.7 μm色谱柱
XSelect™ CSH130 C18 XP，2.5 μm色谱柱
MassPREP™肽混合物
经LCGC认证的内插管透明玻璃样品瓶
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关键词
反相、肽、三氟乙酸(TFA)、甲酸(FA)、离子对、表面带电杂化(CSH)、峰容量

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引言
无论是通过自上而下的蛋白质组学对蛋白质进行研究1还是运用肽图表征生物药物2，肽分离技术都极其重要。这些分析中所遇到的混合物均具有内在的复杂性。因反相(RP)色谱法具有较高的分辨率，并且能够轻松地与质谱法(MS)衔接，它已成为首选的分离方法。与梯度反相色谱关系最紧密的性能指标是峰容量，或在梯度时间内的最大峰数量3。有趣的是，除使用较小的填料颗粒外，对固定相进行化学修饰也可以对峰容量产生显著的影响。例如，表面带电杂化(CSHTM)C18色谱柱的化学特性是对亚乙基桥杂化(BEH)C18固定相的改进4，因为除了C18键合相外，其表面经修饰后还带有低水平的正电荷5。业已表明，这种修饰能够改善离子化小分子的峰形、载量行为和峰容量5-10。

在本研究中，我们评估了CSH130 C18的肽分离特性，期望能够在色谱性方面得到相似的改善，因为在常用的酸性条件下，大部分肽都带有正电荷。针对肽所做的研究表明，与肽分析中先进的固定相相比，这种新型的固定相能够具有更大的峰容量、独一无二的选择性，并且对MS信号的依赖性更低。
LC条件
实验
系统：Waters® ACQUITY UPLC H-Class Bio系统，配有一个20 cm或30 cm的柱温箱(150 mm色谱柱采用20 cm柱温箱；250 mm色谱柱采用30 cm柱温箱)
检测：配备500 nL分析流通池的ACQUITY UPLC TUV检测器；Xevo G2 QTof质谱仪
波长： 214 nm
扫描速率 ： 10 Hz
色谱柱:
ACQUITY UPLC BEH130 C18，2.1 x 150 mm，1.7μm，多孔型，130 Å(部件编号186003556）
ACQUITY UPLC BEH130 C182.1 x 150 mm，1.7 μm，多孔型，130 Å (部件编号186006938)
XSelect CSH130 C18 XP，2.1 x 150 mm，2.5 μm，多孔型，130 Å (部件编号186006943)
C18，2.1 x 250 mm，5μm，多孔型，300 Å(竞争厂家产品)
C18，2.1 x 150 mm,1.7μm，表面多孔型(核心1.25μm，外壳0.22μm)100 Å(竞争厂家产品)
柱温： 40 °C
样品温度： 10℃
进样量： 10 μL
流速： 0.3 mL/min
流动相： A：0.1%FA(v/v)水溶液 B:0.1%FA(v/v)的乙腈(ACN)溶液 C：0.1%三氟乙酸(TFA)(v/v)水溶液 D：0.1%TFA(v/v)的乙腈溶液
样品瓶： 经LCGC认证的透明玻璃瓶12 x 32 mm螺纹口样品瓶(部分编号186001126C)
梯度： 2% ACN维持1分钟，然后增加至50% ACN，维持60 分钟（酸组分由定量配比的流动相A/B和C/D控制)。

质谱条件
质谱仪： Xevo G2 Qtof
电离模式： ESI+
分析仪模式： 分离度
毛细管电压： 3.00 Kv
锥孔电压： 25 V
离子源温度： 120 ℃
脱溶剂温度： 350℃
锥孔气体流速： 0.0 L/h
脱溶剂气体流速：800 L/h
校正： NaI 2 μg/μL，50 ~ 2000 m/z
采集： 50 ~ 1990 m/z，10 Hz 扫描速率
数据管理： MassLynx®软件
样品描述
如表1所示，MassPREP肽混合物(部件编号186002337)使用0.1%FA水溶液重新溶解，使总肽浓度大约为0.6 mg/mL。

 



结果与讨论
肽分离
MassPREP肽混合物含有9种不同的肽，氨基酸组成、质量、长度和极性各有不同。肽序列如表1所示。由于该混合物由这样一组多样的肽组成，所以对于评价质谱性能和色谱性能是很有用的。鉴于此，相对于其他常用于肽分析的固定相，肽混合物被用作检测CSH130 C18的分离性能。本研究还包括用于高效分离混合物中大孔径肽(100 Å ~ 300 Å)的固定相，这些肽的分子量均低于 3kDa。另一个单独的应用纪要对使用130 Å孔径的CSH130 C18分离更大的多肽进行了讨论。11为了研究相关性，使混合物中每种肽的上样量与抗体肽图所用的常用条件接近，其中20 ~ 50 μg的Lys-C消化液或胰蛋白酶消化液一般在内径为2.0 mm或2.1 mm的色谱柱上进行分析。2,12-13同样，分离使用含有强离子对试剂TFA、较弱的离子对试剂FA或两者结合的流动相完成。肽反相分离通常与质谱联用，在各种条件下得到的性能颇引人注意。在这些应用中，因为甲酸能够提供灵敏度更高的检测，所以选用甲酸而非三氟乙酸作为流动相添加剂。14-15

图1是在不同的流动相条件下使用一根5 μm硅胶C18色谱柱得到的三张MassPREP的色谱图。使用TFA进行分离得到的色谱峰一般都是对称的。大部分色谱峰并未出现过度的峰展宽或拖尾的现象。但是，使用含有甲酸的流动相得到的峰形极不理想。此外，混合物中最大的肽——蜂毒素并未被检测出来，原因可能是峰过宽或根本没洗脱出来。对于使用HPLC进行的肽分离，这样的结果是很常见的。

使用亚2 μm颗粒可让肽分离的性能更加优越。在两种均以1.7 μm颗粒填充的色谱柱上得到的色谱图见图2和图3。特别是图2中的色谱图，它们使用表面多孔型C18色谱柱得到。在流动相中加入TFA时，得到的色谱峰是对称的，并且一般比使用5 μm多孔型C18色谱柱得到的色谱峰更窄，如图1所示。在流动相中加入极少量TFA或者不加TFA时，色谱峰变宽并出现明显拖尾。在所有测试条件下，全多孔BEH130 C18色谱柱分离的效果与表面多孔型C18色谱柱相当，如图3所示。



图1至图3表示的分离用于检测CSH130 C18,1.7 μm色谱柱肽分析的性能。对应的色谱图如图4所示。图1至图4的对比清楚表明，无论是使用含有TFA还是FA的流动相，与其他色谱柱不同的是，CSH130 C18都能够提供最佳的峰形。此外，可以明显看到，CSH130 C18 表现出独一无二的选择性——尤其使用不含TFA的流动相情况下。例如，在流动相中仅加入0.1%的甲酸，在本研究所用的其他任何色谱柱上(CSH130 C18除外)，肽8和肽9均未得到很好的分离。而使用CSH130 C18时，这两种洗脱是峰形对称并在3分钟以上的时间内分实现分离。另外，这些色谱柱之间也存在保留能力的差异。最值得注意的是，CSH130 C18色谱柱的保留能力稍弱于本研究涵盖的其他色谱柱。这正好印证了CSH130 C18是唯一一种表面带有少量正电荷吸附剂的事实。带正电荷的肽与CSH130 C18表面之间的库仑斥力很可能是CSH130 C18保留能力较低的原因。图4的插图显示了在CSH130 C18色谱柱上使用0.1%FA梯度时的最早洗脱部分。在这些条件下，亲水性最强的肽RASG-1(肽1)在孔隙体积标记附近出峰。与BEH130 C18色谱柱相比，一般使用CSH130 C18洗脱肽时所使用的ACN的量要少2% ~ 4%。 使用0.1%TFA时，保留能力的差异最小，而使用0.1%FA时，保留能力差异最大。分析极性很大的肽时，CSH130 C18的初始梯度条件可能需要作相应的调整。

 

峰容量和质谱信号
对这些定性分离的比较表明CSH130 C18比其他色谱柱具有性能上的优势。但是，定量更引人注目。在每个分离中观察到的峰容量按照实验部分的方法计算。图5A显示了在每种色谱柱上酸性改进剂组成与峰容量之间的关系。图5A的左部分是仅使用FA而不使用TFA离子对试剂得到的峰容量值。沿X轴向右是与FA浓度降低、TFA浓度升高时对应的峰容量值。CSH130 C18色谱柱的性能优势很容易显现出来。使用0.1%TFA时，CSH130 C18色谱柱的峰容量比其他1.7 μm C18色谱柱大20%。但是，如果使用含有0.1%甲酸的流动相，CSH130 C18色谱柱的峰容量比其他1.7 μm色谱柱大90%。因此，CSH130 C18不仅比其他色谱柱具有更大的峰容量，而且其性能对三氟乙酸的依赖性很小。由此带来的最明显效果是CSH130 C18色谱柱与质谱具有很高的兼容性。在这些分析中，三氟乙酸对肽质谱检测的影响见图5B。我们知道，在电喷雾离子化过程中，TFA会引起严重的离子抑制16-17。因此，使用TFA而不使用FA时，质谱信号降低12倍。CSH130 C18色谱柱并不需要太多TFA(如果有)来获得最佳峰容量，因此成为需要高灵敏度LC/MS应用的理想选择。

 

粒径和UPLC/HPLC的放大性
许多肽分离操作仍在传统的HPLC仪器上进行。因其背压过高，使用亚2 μm填充的色谱柱通常不适合与HPLC系统联用。而2.5 μm色谱柱因其背压较低可以在任何LC仪器上使用。为确定CSH130 C18,1.7μm色谱柱得到的峰容量是否可以成功转移到CSH130 C18 XP,2.5 μm色谱柱上，针对2.5 μm XP色谱柱设置了一种从一根1.7μm色谱柱转移出来的HPLC兼容的方法。这种转移如下所述：按照ACQUITY UPLC色谱柱计算器的建议18，将流速降低，增加梯度时间，降低和增加的系数均为1.5。图6显示，使用1.7 μm色谱柱进行的分离成功地转移到了2.5μm XP色谱柱上。选择性系数的一致性强调了这一观察结果，如表2所示。与1.7颗粒的色谱柱相比，使用2.5μm XP颗粒进行分离时背压出现极大地降低(~3000psi比 ~8000 psi)，从而表明了CSH技术可以轻松应用于UPLC或HPLC进行的高峰容量肽分离中。

 


结论
由于创新性的施加了低水平的正电荷，CSH 130 C18色谱柱已经被证明是一种能够实现肽分离的技术。根据对9种肽混合物进行分析，我们发现，与非表面带电的C18色谱柱相比，CSH 130 C18显示出更高的峰容量和独一无二的选择性。经过观察，CSH 130 C18色谱柱的性能对强离子对试剂(例如TFA，可以抑制电喷雾离子化)的依赖性显著降低。此外，在背压较小的HPLC条件下，使用CSH 130 C18,1.7 μm色谱柱得到的分离结果可以转移到CSH 130 C18,2.5 μm XP色谱柱上——尽管以牺牲分析时间为代价。CSH 130 C18可以使用不同的粒径，便于采用UPLC作为常规使用(以往这些实验室的日常使用被限制在HPLC仪器上)，也可以拓展到压力上限为9000~12000psi的UHPLC上。

参考文献
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