来宝网 2025/5/26点击200次
UbiTest缓冲液：高特异性泛素化检测的关键
泛素蛋白酶体系统（UPS）是一种高度调控的机制，通过蛋白质的泛素化和降解来控制许多细胞过程。泛素通过其C末端与目标蛋白上的赖氨酸残基结合，可以以单体形式或聚合链形式存在。泛素链可以通过泛素的第一个甲硫氨酸（M1）形成线性链，也可以通过其七个赖氨酸残基（K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63）形成特定赖氨酸链。K48和K63连接的泛素链是细胞中最为主要的多泛素化形式。
泛素化是一个可逆的过程，去泛素化酶（DUBs）可以去除目标蛋白上的泛素，从而拯救它们免于蛋白酶体降解。确定目标蛋白上的多泛素化程度和类型对于理解它们在正常细胞过程以及与UPS相关疾病状态中的泛素介导调控至关重要。传统上，这些过程是通过质谱分析或使用抗泛素抗体进行免疫沉淀后，再进行免疫印迹来监测的。然而，在免疫印迹步骤中，由于表位掩盖、亲和力降低或蛋白质多泛素化导致的选择性变化，底物抗体常常与底物的多泛素化形式产生不同的相互作用。
图1：UbiTest检测的示意图：通过磁性TUBEs捕获富集泛素化蛋白，然后从TUBEs中洗脱。分离的多泛素化洗脱液被分成两部分：一部分保持未处理状态，而第二部分用广谱去泛素化酶（DUB）消化以去除泛素链。两部分均使用针对目标蛋白（POI）的抗体进行免疫印迹分析。从多泛素化POI上去除泛素链后，在免疫印迹中可以看到一个单一的、未修饰的POI条带。
一种更明确的证明蛋白质泛素化的方法是，在免疫印迹分析之前，将免疫沉淀与使用广谱去泛素化酶（DUB）进行去泛素化相结合。如果在经过DUB处理后，目标蛋白（POI）的信号增强，这表明该蛋白即使在未处理的样本中没有明显的反应性，也已经发生了泛素化。
LifeSensors的UbiTest检测利用TUBEs（串联泛素结合实体）来捕获多泛素化蛋白，以避免由于POI免疫反应性变化而可能出现的问题。TUBEs是经过工程改造的串联泛素结合结构域，其与多泛素的解离常数在纳摩尔范围内。LifeSensors的泛选择性TUBEs已被证明能够结合所有八种泛素连接类型。
为了确定目标蛋白上多泛素化的连接类型，LifeSensors开发了一种更具针对性的方法，该方法在免疫印迹分析之前使用特定连接类型的DUB。如果在经过K48/K63特异性DUB处理后，与未修饰POI对应的条带信号增强，则表明该蛋白发生了K48/K63多泛素化。
艾美捷UbiTest缓冲液（#LSS-UM-0411-3000）相关产品：
UE103：UbiQuant S试剂盒
UE905：UbiQuant Ultra微孔板
UM413：K63连接特异性UbiTest试剂盒——琼脂糖TUBE洗脱试剂盒
UM201-1MG：抗泛素TUBE 1，His6
UM102：TUBE 2（GST）
https://www.amyjet.com/products/LSS-UM-0411-3000.shtml
K63 TUBE(磁珠)，对多泛素的亲和力高于大多数泛素抗体
串联泛素结合实体（TUBEs）的使用正在成为泛素研究中不可或缺的策略（1, 2）。第一代TUBEs能够与K48和K63连接的四聚泛素链结合，其解离常数（Kds）在个位数纳摩尔范围内，比单体UBAs的结合强度高出约100到1000倍。TUBEs还可以在没有通常用于阻断此类活性的抑制剂的情况下，保护蛋白质免受去泛素化酶（DUBs）和蛋白酶体的降解。这使得在比上述条件更不易改变细胞生理学的情况下，能够高效地从细胞系、组织和器官中分离天然多泛素链及其附着的蛋白质。TUBE 1和TUBE 2最近已被证明能够富集所有多泛素链连接类型，且不加区分，即使目标蛋白的连接类型未知，这些试剂也适用。
K63 TUBE的开发是为了对K63连接的多泛素链（约20纳摩尔）显示出比所有其他连接类型（>2微摩尔）更高的选择性。它可以单独使用，也可以与我们的其他TUBE产品（特别是K48 TUBE HF和M1（线性）TUBE）结合使用，以研究底物蛋白中的多泛素链连接类型。磁性TUBEs是直接与磁性珠子偶联的TUBE部分，用于通过Western blotting和/或下游蛋白质组学研究来鉴定和表征多泛素化蛋白。磁性TUBEs便于实现多泛素化蛋白的便捷“一步”捕获。
艾美捷K63 TUBE(磁珠)：
货号：UM-0404M-1000
分子量：不适用
物理状态：液体
数量：1 mL
浓度：可变
储存：+4℃，避免在此温度以下储存
K63 TUBE(磁珠)应用：
从细胞和组织提取物中分离和富集K63多泛素化蛋白
分离K63多泛素化蛋白用于蛋白质组学研究
K63 TUBE(磁珠)优势：
对K63多泛素链的偏好性比其他所有连接类型高出100倍
TUBEs对多泛素的亲和力高于大多数泛素抗体
避免过度表达用于捕获的表位标签泛素
K63 TUBE(磁珠)文献参考：
Hershko, A., and Ciechanover, A. (1998) The ubiquitin-proteasome pathway, Ann Rev Biochem 67, 425- 479.
Messick, T. E., and Greenberg, R. A. (2009) The ubiquitin landscape at DNA double-strand breaks, J Cell Biol 187, 319-326.
Balut, C. M., Loch, C. M., and Devor, D. C. (2011) Role of ubiquitylation and USP8-dependent
deubiquitylation in the endocytosis and lysosomal targeting of plasma membrane KCa3.1, FASEB J 25,3938-3948.
Piper, R. C., and Lehner, P. (2011) Endosomal transportation via ubiquitination, Trends Cell Biol 21, 647- 655.
Olzman, J. A., and Chin, L. S. (2008) Parkin-mediated K63-linked polyubiquitination. A signal for targeting misfolded proteins to the aggresome-autophagy pathway, Autophagy 4, 85-87.
Tan, Y. K., Vu, H. A., Kusuma, C. M., and Wu, A. (2009) Implications of autophagy in anthrax
pathogenicity, Autophagy 5, 734-735.
Lim, K. L., and Lim, G. G. (2011) k63-linked ubiquitination and neurodegeneration, Neurobiol Dis 43, 9-16.
Hjerpe, R., Aillet, F., Lopitz-Otsoa, F., Lang, V., England, P., and Rodriguez, M. S. (2009) Efficient protection and isolation of ubiquitylated proteins using tandem ubiquitin-binding entities, EMBO Rep 10, 1250-1258.
Hjerpe, R., and Rodriguez, M. S. (2008) Efficient approaches for characterizing ubiquitinated proteins,Biochem Soc Trans 36, 823-827.
https://www.amyjet.com/products/LSS-UM-0404M-1000.shtml
UM501M：高容量磁珠管1，无需离心，背景更低
基于已知对泛素具有亲和力的蛋白质结构域，串联泛素结合实体（TUBEs）已被开发用于分离和鉴定泛素化蛋白。 与单个泛素结合相关结构域（UBA）相比，TUBEs对多泛素结构的亲和力可增加多达1000倍。此外，TUBEs对多泛素化蛋白具有保护作用，即使在相对较低的丰度下也能检测到。这些特性有效地“捕获”了处于多泛素化状态的蛋白质。TUBEs可用于从细胞和组织提取物中分离、富集和鉴定泛素化蛋白。与TUBE 1偶联的磁性珠子可以在一步中高效回收多泛素化蛋白，无需离心。这种磁性TUBEs能够更彻底地去除未结合的上清液，从而降低背景。多泛素化蛋白可以轻松地从TUBEs中分离出来，用于蛋白质组学研究或通过Western blotting进行鉴定。
UM501M是通过涂覆聚合物高容量磁性珠子设计的，以实现对多泛素化蛋白的卓越富集，同时最小化在组织和细胞裂解液中与蛋白质的非特异性结合。
艾美捷UM501M：高容量磁珠管1：
货号：UM-0501M-1000
物理状态：液体
数量：1 mL磁性珠子
浓度：可变
储存：+4℃，避免在此温度以下储存
UM501M：高容量磁珠管1应用：
从细胞系、组织和器官中捕获多泛素化蛋白
分离多泛素化蛋白用于蛋白质组学研究
保护多泛素化蛋白免受去泛素化和蛋白酶体降解
UM501M：高容量磁珠管1优势：
一步回收多泛素化蛋白
无需离心，背景更低
从TUBEs中高效分离多泛素化蛋白
亲和力比单个UBA结构域高出多达1000倍
避免为捕获而过度表达亲和标签泛素
文献参考：
Hjerpe, R, Aillet, F, Lopitz-Otsoa, F, Lang, V, England, P, and Rodriguez, MS., Efficient protection and isolation of ubiquitylated proteins using tandem ubiquitin-binding entities. EMBO Rep. 10,1250-1258 (2009).
Stormo, Adrienne ED, Farbod Shavarebi, Molly FitzGibbon, Elizabeth M. Earley, Hannah Ahrendt, Lotus S. Lum,Erik Verschueren et al (2022) "The E3 ligase TRIM1 ubiquitinates LRRK2 and controls its localization,degradation, and toxicity." Journal of Cell Biology 221, no. 4.
Sarbanes, Stephanie L., Vincent A. Blomen, Eric Lam, Søren Heissel, Joseph M. Luna, Thijn R. Brummelkamp,Erik Falck-Pedersen, H-Heinrich Hoffmann, and Charles M. Rice. (2021) "E3 ubiquitin ligase Mindbomb 1 facilitates nuclear delivery of adenovirus genomes." Proceedings of the National Academy of Sciences 118, no. 1: e2015794118.
https://www.amyjet.com/products/LSS-UM-0501M-1000.shtml
[干冰]K63连接的四聚泛素，助力细胞信号传导研究
通过K63对目标蛋白的多泛素化最近成为了研究的热点。这种连接类型的拓扑结构与通过赖氨酸48连接的多泛素链有很大不同。蛋白质通过K63连接的多泛素化修饰已被证明与多种细胞过程有关，包括DNA损伤响应的调控、内体分选、错误折叠/聚集蛋白的自噬、神经退行性以及信号转导。四聚泛素链是通过野生型泛素的酶促连接，通过赖氨酸63生成的。最远端的泛素在第63位赖氨酸上含有一个精氨酸替代，限制了链的长度。
艾美捷[干冰]K63连接的四聚泛素：
货号：SI-6304-0025
纯度：通过Western blot分析，纯度> 95%
分子量：34,233.4 Da
物理状态：液体；20 mM Tris-HCl，pH 7.5，0.15 M NaCl，1 mM EDTA
数量：25 ug
溶解度：>1 mg/mL
储存：-80℃。避免反复冻融
浓度：批次依赖，请参阅分析证书或瓶签以获取实际浓度
[干冰]K63连接的四聚泛素图片：
[干冰]K63连接的四聚泛素是研究多泛素化修饰的理想工具，为科研人员提供了高纯度、高稳定性和高特异性的实验材料，助力深入探索细胞内复杂的生物学过程。
https://www.amyjet.com/products/LSS-SI-6304-0025.shtml
PR-619，低浓度范围内抑制去泛素化酶
PR-619是一种非选择性、可逆的去泛素化酶（DUBs）和泛素样异肽酶的抑制剂。PR-619能够在5-20 uM的浓度范围内抑制许多去泛素化酶。此外，PR-619具有细胞通透性，细胞处理后会导致泛素和SUMO结合蛋白的积累。
艾美捷PR-619：
货号：SI-9619
分类：DUB抑制剂，小分子调节剂和PROTACs
标签：DUB抑制剂，小分子调节剂和PROTACs
纯度：≥ 95%（反相高效液相色谱）
数量：5 mg；25 mg
分子量：223.28 Da；实测M+H+=224.11
物理状态：干粉
溶解度：在DMSO中> 5 mg/mL
CAS号：无
储存：4℃，长期储存可低至-20℃
重量：5 mg，25 mg
应用
非特异性异肽酶抑制
细胞生物学
制备细胞/组织裂解液
药物发现
优势：细胞可渗透
https://www.amyjet.com/products/LSS-SI-9619-0005.shtml
[干冰]K48连接的四聚泛素-助力深入探索细胞内复杂的生物学过程
通过K48连接对目标蛋白的多泛素化是各种泛素链连接类型中研究最为透彻的。 现在已经明确，许多（如果不是全部的话）多泛素链的拓扑结构可能在调控细胞过程中发挥独特且重要的作用。然而，K48连接仍然是细胞维持蛋白质稳态的关键途径，并且对于研究在调控降解过程中发挥作用的去泛素化酶（DUBs）以及蛋白酶体本身仍然具有吸引力。这些四聚泛素链是通过野生型泛素通过赖氨酸48的酶促连接（E2-25K）生成的。最远端的泛素在第48位赖氨酸上含有一个精氨酸替代，限制了链的长度。
艾美捷[干冰]K48连接的四聚泛素：
货号：SI-4804-0025
纯度：通过Western blot分析，纯度> 95%
分子量：34,233.4 Da
物理状态：液体；20 mM Tris-HCl，pH 7.5，0.15 M NaCl，1 mM EDTA
数量：25 ug
溶解度：>1 mg/mL
储存：-80℃。避免反复冻融。
浓度：批次依赖，请参考分析证书或瓶签以获取实际浓度。
[干冰]K48连接的四聚泛素图片：
[干冰]K48连接的四聚泛素是研究多泛素化修饰的理想工具，为科研人员提供了高纯度、高稳定性和高特异性的实验材料，助力深入探索细胞内复杂的生物学过程。
https://www.amyjet.com/products/LSS-SI-4804-0025.shtml
[干冰]K48连接的双泛素，在调控细胞过程中发挥独特且重要的作用
通过K48位点连接的目标蛋白的多泛素化，是目前研究最为透彻的泛素链连接方式，我们曾经认为这是这种翻译后修饰的标志。K48二聚泛素（或称K48连接的二聚泛素）一直处于这一研究领域的前沿。如今已经明确，许多（如果不是全部的话）多泛素链的拓扑结构可能在调控细胞过程中发挥独特且重要的作用。然而，K48连接仍然是细胞通过蛋白水解降解维持稳态的关键途径，因此对于研究在降解过程中发挥作用的去泛素化酶（DUBs）以及蛋白酶体本身仍然具有极大的吸引力。这些二聚泛素链是通过野生型泛素通过赖氨酸48的酶促连接生成的。最远端的泛素在第48位赖氨酸上含有一个精氨酸替代，限制了链的长度。
艾美捷[干冰]K48连接的双泛素：
货号：SI-4802-0100
纯度：通过Western blot分析，纯度> 95%
分子量：17,139.7 Da
物理状态：液体；20 mM Tris-HCl，pH 7.5，0.15 M NaCl，1 mM EDTA
数量：100 ug
溶解度：>1 mg/mL
储存：-80℃。避免反复冻融。
浓度：批次依赖，请参考分析证书或瓶签以获取实际浓度。
[干冰]K48连接的双泛素图片：
[干冰]K48连接的双泛素是研究多泛素化修饰的理想工具，为科研人员提供了高纯度、高稳定性和高特异性的实验材料，助力深入探索细胞内复杂的生物学过程。
https://www.amyjet.com/products/LSS-SI-4802-0100.shtml
[干冰]SUMOstar蛋白酶--高活性且稳定的酶
LifeSensors的SUMOstar蛋白酶是一种高活性且稳定的酶，它是通过基因工程从酵母Ulp1改造而来的（见产品编号#4010L）。SUMOstar源自酵母SUMO，经过工程改造后能够抵抗内源性去SUMO化酶的切割，从而允许在真核表达系统中表达SUMOstar融合蛋白。SUMOstar蛋白酶被设计为特异性去除SUMOstar。与SUMO蛋白酶1类似，SUMOstar蛋白酶识别SUMOstar的三级结构，因此不会在目标蛋白内部进行切割。SUMOstar蛋白酶在广泛的温度（30℃为最佳）、pH值[5.5-9.5]和离子强度范围内都能发挥作用。SUMOstar蛋白酶在N端含有His6标签，便于通过亲和层析去除。
艾美捷[干冰]SUMOstar蛋白酶：
货号：SP-4110-0250
应用：从重组融合蛋白中去除SUMOstar标签。
纯度：通过SDS-PAGE和反相高效液相色谱（RP-HPLC）分析，纯度>95%
分子量：26,481.3 Da
比活：1单位（U）的SUMOstar蛋白酶能够在1小时内，在37℃条件下切割超过90ug的SUMOstar-GFP
物理状态：液体，浓度为10 U/µL
数量：500、1000、5000或10,000单位
储存：-80℃。避免反复冻融。
[干冰]SUMOstar蛋白酶图片：
文献参考：
1. Li, S.-J. and M. Hochstrasser. 1999. A new protease required for cell cycle progression in yeast. Nature 398,246-251.
2. Li, S.-J., W. Hankey, and M. Hochstrasser. 2005. Preparation and characterization of yeast and human desumoylating enzymes. Meth Enzymol 398,457-467.
3. Malakhov, M.P., M.R. Mattern, O.A. Malakhova, M. Drinker, S.D. Weeks, and T.R. Butt. 2004. SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins. J Struct Funct Genomics 5,75-86.
https://www.amyjet.com/products/LSS-SP-4110-0250.shtml
