来宝网 2026/2/26点击122次
在ELISA实验中是否需要设置对照？答案当然是肯定的。
ELISA数据有效性的验证离不开阳性、阴性和空白这3项对照。那么，有哪些物质可以担当这些对照呢？又该如何设置？需要设置几个孔位呢？阳性对照、阴性对照和空白对照这类平行对照（Parallel Control）是为了确保实验结果准确性、可靠性和可重复性而设计的关键实验环节。
源自文献：SIVAJI and SRIDAR, Impact of Bt Cotton on the Functional Microbes in the Rhizosphere Under In Vitro Condition
「ELISA问诊室」我们将细数对照设置有关的常见问题。
空白对照（Blank Control）
空白对照是为了观察显色反应的本底，在计算样本的OD值时需要减去空白对照的OD值，以消除酶标仪的本底。同样，阳性对照、阴性对照的数据也应减去空白对照的本底吸光值。
有3类物质可以作为空白对照：
1）超纯水、稀释液：用于仪器调零，所有孔数值减掉该孔数值。
2）显色底物：只加底物和终止液，防止底物弱显色所造成的读数偏高，同样所有孔数值应减掉该数值。
3）酶：为了检测酶是否与酶标板有非特异性结合，大部分情况下不需要做这个空白对照。
阳性对照（Positive Control）
已知的、含有靶蛋白的内源性可溶样品，或能够被抗体检测到的纯化蛋白（如标准品），可用来设置阳性对照（品）。通过查阅文献可以找到合适的组织活细胞样品，查找蛋白的GeneCards数据库可以找到靶蛋白在各种组织中的表达水平。
如果我们检测重组蛋白样品，建议在实验中加入内源性阳性对照。这是因为重组蛋白的折叠可能与天然蛋白存在差异，会影响抗原和抗体的表位结合。内源性阳性对照与试剂和实验过程的有效性息息相关。
设置阳性对照主要有两种作用，一是评价该项实验结果是否有效及其稳定性和可比性，如果阳性对照显色正常说明实验有效，反之则需要考虑实验操作过程中可能存在的问题。二是在此基础上计算检测的临界值（即Cut off）。比如在临床检测中，临界值代表标志物在健康人群中正常值范围的上限，待检样本检测值超过该上限时表示有诊断意义。
阴性对照（Negative Control）
与阳性对照相反，使用已知的、不含靶蛋白的同源性可溶样品，比如不含待检蛋白的血清、细胞培养物或其它样品。阴性对照同样反映实验结果的准确性，检测非特异结合及错误的阳性信号（假阳性）。
阴性对照的OD值不一定是0，可以是比较低的数值，只要与样品信号值比较，保证良好的信噪比即可。比如在2022年的一篇研究文章中，研究人员为了深化冠状病毒致病机制和设计减毒疫苗，使用义翘神州的SARS-CoV-2 RBD ELISA试剂盒（货号：KIT002）对样本血清的抗体水平进行测试。其中以健康人和未感染冠状病毒小鼠的血清样本为阴性对照。
源自文献：Shanshan Lu, et al. Doi: 10.1080/22221751.2022.2151383
出现假阳性/假阴性的原因
ELISA实验中，样本中实际上不存在靶蛋白或抗体，但在检测结果中却出现了显色反应，这就是假阳性结果。反之本应该存在的样品却检测不到信号，就会造成假阴性。出现这些问题的原因涉及ELISA的多个方面，如样本存放、操作细节、设备仪器使用等。
1）样本因素
血清是ELISA实验中常见的样本类型，引起的假阳性和假阴性结果主要是干扰物质所致，主要有内源性物质和外源性物质两大类。
基因突变、待检物含量偏低易造成假阴性结果。
易造成假阳性结果的内源性物质有：血清中IgM、IgG型类风湿因子、补体、嗜异性抗体、抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等嗜靶抗原的自身抗体、抗鼠性抗体、类地高辛、类AFP样物质等。如果血清脂质过高，胆红素、血红蛋白及血液粘度过大，均会对ELISA检测结果产生干扰。
外源性物质主要是血液样本采集或保存不当造成，比如样本溶血、被细菌污染、凝集不全等。
外源性物质 | 可能造成的实验结果 |
样本处理不彻底，含有纤维蛋白原 | 造成洗板不彻底，使反应孔吸光度值偏高，出现假阳性 |
样本溶血，红细胞溶解释放大量具有过氧化物酶活性的血红蛋白 | 会造成HRP体系非特异性显色，出现假阳性 |
样本被细菌污染，细菌可能含有过氧化物酶 | 造成弱的假阳性反应 |
样本保存过久，血清中IgG聚合，或者抗原或抗体免疫活性降低 | IgG聚合会造成间接ELISA测定中本底加深甚至出现假阳性，而免疫活性降低可能会造成假阴性 |
样品反复冻融使抗体效价下降 | 易造成假阴性结果 |
抗凝剂（如肝素、EDTA）、酶抑制剂（NaN3）抑制HRP活性 | 在间接法、夹心法中易导致假阴性结果 |
塑料试管能吸附抗原或抗体，样本久置会使其含量下降 | 易造成假阴性结果 |
2）操作因素
ELISA操作相对简单，易于标准化，但是一些操作细节也会影响其结果，如加样、洗剂、孵育等。加样时要将样本加在ELISA板孔底部，避免加在孔壁上部并不可溅出，不可产生气泡。
洗板是ELISA实验中保证可得到重复结果的关键一步。手洗操作要熟练，力度和手法是关键。洗板机要保证无堵塞，否则容易花板，造成假阳性或假阴性。
在ELISA实验中，每种试剂都有其合适的反应模式。温度和时间的控制是关键因素。在温育时，酶标板不宜叠放，需保证各板温度均一。为避免蒸发，酶标板应加盖。要避免环境中强氧化剂、挥发性物质等对实验结果的干扰，定期清洁实验室环境。还需定期校检移液器、酶标仪、孵育箱等设备仪器，保障其性能稳定可靠。
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笔者的一点小小建议，实验前一定要仔细阅读产品说明书，并按照说明书做好实验前准备工作。如果是自己开发ELISA实验方法，除了查阅参考文献，还需要科学的设置阳性对照和阴性对照。欢迎关注义翘神州或添加小助手“sinobio2023"进行联系！
