非洲猪瘟单抗制备及配对测试…

非洲猪瘟单抗制备及配对测试初步调试
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详细介绍
  • 参考报价:3000 产地:山东 品牌:蓝都生物 型号:配对测试 更新时间:2024/10/23

非洲猪瘟单抗制备及配对测试初步调试

非洲猪瘟单抗制备实验进程

 

1、免疫时间计划表

 

实验进程

日期

初免

2021.03.26

二免

2021.04.02

三免

2021.04.09

四免

2021.04.16

融合

2021.04.19

筛选

2021.04.26

亚一筛选

2021.05.02

亚二筛选

2021.05.08

亚三筛选

2021.05.14

腹水

2021.05.23


2、免效价、抗体特异性

加入免疫抗体100μL /孔, 轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应20min。小心揭开盖板膜,将孔内液体甩干,加入洗涤工作液250μL/孔,每次静置20s,甩去孔内液体,重复洗涤3次,一次用吸水纸拍干。再加入酶标物100μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应20min。小心揭开盖板膜,将孔内液体甩干,加入洗涤工作液250μL/孔,每次静置20s,甩去孔内液体,重复洗涤3次,用吸水纸拍干。加入底物液A50μL/孔,再加底物显色B50μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min

结果及结论见下表

 


Ag 500

Ag 1k

 1-Ab 500

4.71

4.28

1-Ab 5k

3.58

3.12

 2-Ab 500

4.52

3.97

2-Ab 5k

2.45

2.01

结论

1Ag包被浓度为3K倍。

2、二免效价较高。

 

 

 

 

 

 

3、筛选效价

3.1 筛选效价

加入酶标物50μL /孔, 再加入细胞上清50μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜,将孔内液体甩干,加入洗涤工作液250μL/孔,每次静置20s,甩去孔内液体,重复洗涤3次,用吸水纸拍干。加入底物液A50μL/孔,再加底物显色B50μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min结果见下图:

202407190856359663.png
        

 

                                                        

 

                                                                 

 

 

      

                                                

 

 

 








image.png


 

结论:共选62个阳性孔的细胞进行抗体特异性测定。

3.2 筛选抗体特异性

加入酶标物50μL /孔, 再加入细胞上清50μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜,将孔内液体甩干,加入洗涤工作液250μL/孔,每次静置20s,甩去孔内液体,重复洗涤3次,用吸水纸拍干。加入底物液A50μL/孔,再加底物显色B50μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min结果见下图:

 

 image.png

 

 

 

 

 

结论:共选出14株效价高、抗体特异性好的细胞进行亚克隆。

株号有:2C四 3B9 3D6 3F10 4D1 4F4 5D2

      5D4 5D7 7D4 7D7 7C8 8G10 4F10

 

4、亚一筛选效价

加入酶标物50μL /孔, 再加入细胞上清50μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜,将孔内液体甩干,加入洗涤工作液250μL/孔,每次静置20s,甩去孔内液体,重复洗涤3次,用吸水纸拍干。加入底物液A50μL/孔,再加底物显色B50μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min

 image.png

 

结论:共选出10株效价高的细胞进行第二次亚克隆。

株号有:2C四 3D6 3F10 4F4 5D2 5D4 5D7 7D4 8G10 4F10

 

 

 

 

5、亚二筛选效价

加入酶标物50μL /孔, 再加入细胞上清50μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜,将孔内液体甩干,加入洗涤工作液250μL/孔,每次静置20s,甩去孔内液体,重复洗涤3次,用吸水纸拍干。加入底物液A50μL/孔,再加底物显色B50μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min

 

结论:经显微镜观察,有四株细胞纯阳性(5D2 5D4 5D7 3F10)扩大并冻存; 有六株细胞细胞进行第三次亚克隆。

三次亚克隆株号有:2C四 3D6 4F4 7D4 8G10 4F10

 

6、亚三筛选效价

加入酶标物50μL /孔, 再加入细胞上清50μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜,将孔内液体甩干,加入洗涤工作液250μL/孔,每次静置20s,甩去孔内液体,重复洗涤3次,用吸水纸拍干。加入底物液A50μL/孔,再加底物显色B50μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min

 

结论:经显微镜观察,有四株细胞纯阳性(8G10 2C四 4F4 7D4 )扩大并冻存;

      4F103D6株细胞转阴性,扔之。

 

 

 

 

 

7.腹水效价

将筛选到的非洲猪瘟8株单抗,制备腹水并测腹水效价。

加入酶标物50μL /孔, 再加入稀释后的抗体50μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜,将孔内液体甩干,加入洗涤工作液250μL/孔,每次静置20s,甩去孔内液体,重复洗涤3次,一次用吸水纸拍干。加入底物液A50μL/孔,再加底物显色B50μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min

结果及结论见下表

 

细胞株

Ab-5w

Ab-10W

效价

2C四

3.98

3.17

>10w

3F10

3.29

1.63

>10w

4F4

3.54

1.55

>10w

  5D2 

4.37

2.11

>10w

  5D4 

3.54

1.62

>10w

5D7

3.96

1.91

>10w

7D4

4.19

2.54

>10w

8G10

1.36

0.84

10w

结论

非洲猪瘟筛选到8株单克隆抗体,腹水效价10w以上。

 

非洲猪瘟单抗配对初步测试

ASFV8Ab,各按生产条件标记1条金垫后测试结果

标记:1.2C四  2.3F10  3.4F4  4.5D2  5.5D4  6号.7D4   7号.8G10   8号.混合 9号.兔多抗

划线:9Ab同时划9T线,1/1稀释.稀释液是动物CB液

(一) 金垫标记:1-8号单抗;T线:兔多抗划线1:1(动物包被液稀释);

先用 1-8号金条和兔多抗1:1 划线测试阳性病料(1:5,用2*样稀稀释,非处理样品垫),如图1,8-10分观察,结论:爬速过快,需要调整爬速。

image.pngimage.png

接着用 1-8号金条和兔多抗1:1 划线测试阳性病料(1:5,用1*样稀稀释,非处理样品垫),8-10分观察,如图2

image.png

 

结论如下表:

 

 

1-8号金条与兔多抗1:1 测试阳性结果


1号金垫

2号金垫

3号金垫

4号金垫

5号金垫

6号金垫

7号金垫

8号金垫

划线兔多抗1:1

+

+

+-

+

++

-

-

+

 

 

 

 

 

 

 

 

 

继续优化实验方案, 1-8号金条和兔多抗1:1 分别测试阳性病料(1:5,用1*样稀稀释,用滤血膜)和猪阴性血清(1:5,用1*样稀稀释),8-10分观察,分别如图3和图4

image.png

多次实验结论:1,2,3,4,5,8,号抗体与兔多抗(1:1)反应,6,7号抗体与兔多抗(1:1)无反应。并重复复核实验1,2,3,4,5,8,这六种抗体与兔多抗的反应,如图5,证明结论正确。

image.png

 

 

 

 

(二) 颠倒测试,金垫标记:9号兔多抗标记;T线:1,2,3,4,5,8号单抗1:1(动物包被液稀释);

阳性见图6,阴性见图7。  结论1,2号抗体好。

9号兔多抗标记金条与1,2,3,4,5,8号抗体划线测试阴阳性结果



1号Ab划线

2号Ab划线

3号Ab划线

4号Ab划线

5号Ab划线

8号Ab划线

兔多抗标记的金垫

阳性

+

+

+

+

+

+

阴性

+---

+---

+--

+-

+-

+-

 

 

image.png

    

(三) 对摸索到的六株单抗进行交叉配对测试(1.2C四 2.3F10  3.4F4  4.5D2  5.5D4  8号.混合)

1)1号抗体标记金条,依次为2 3 4 5 8号抗体1:1划线,测试阳性(病料1:5稀释,用1*样稀),见图8.测试阴性(猪血清1:5,用1*样稀),结果见图9

image.png



2号Ab划线

3号Ab划线

4号Ab划线

5号Ab划线

8号Ab划线

1号抗体标记的金垫

阳性

+-

+

+

+

+

阴性

+--

+-

+--

+--

+--

 

 

2)2号抗体标记金条,依次为1 3 4 5 8号抗体1:1划线,测试阳性(病料1:5稀释,用1*样稀),见图10.测试阴性(猪血清1:5,用1*样稀),结果见图11

image.png



1号Ab划线

3号Ab划线

4号Ab划线

5号Ab划线

8号Ab划线

2号抗体标记的金垫

阳性

+

++

+

+

++

阴性

+--

+-

+--

+--

+-

 

 

3)3号抗体标记金条,依次为1 2 4 5 8号抗体1:1划线,测试阳性(病料1:5稀释,用1*样稀),见图12.测试阴性(猪血清1:5,用1*样稀),结果见图13

image.png



1号Ab划线

2号Ab划线

4号Ab划线

5号Ab划线

8号Ab划线

3号抗体标记的金垫

阳性

+

+

++

+

++

阴性

+--

+--

+--

+--

+-

 

 

4)4号抗体标记金条,依次为1 2 3 5 8号抗体1:1划线,测试阳性(病料1:5稀释,用1*样稀),见图14.测试阴性(猪血清1:5,用1*样稀),结果见图15

image.png



1号Ab划线

2号Ab划线

3号Ab划线

5号Ab划线

8号Ab划线

4号抗体标记的金垫

阳性

+

+

++

+

+

阴性

+-

+--

+-

+-

+-

 

 

 

5)5号抗体标记金条,依次为1 2 3 4 8号抗体1:1划线,测试阳性(病料1:5稀释,用1*样稀),见图16.测试阴性(猪血清1:5,用1*样稀),结果见图17

image.png



1号Ab划线

3号Ab划线

4号Ab划线

5号Ab划线

8号Ab划线

2号抗体标记的金垫

阳性

+-

++

+

+

++

阴性

+--

+--

+-

+--

+-

 

 

 

6)8号抗体标记金条,依次为1 2 3 4 5号抗体1:1划线,测试阳性(病料1:5稀释,用1*样稀),见图18.测试阴性(猪血清1:5,用1*样稀),结果见图19

image.png



1号Ab划线

2号Ab划线

3号Ab划线

4号Ab划线

5号Ab划线

8号抗体标记的金垫

阳性

++

+

++

+

+

阴性

+--

+--

+-

+--

+-

 

 

 

结论:经重复观察实验,以下四组单抗交叉配对效果较好。

2号抗体(3F10)标记配对3号抗体(4F4 )划线

      2号抗体(3F10)标记配对8号抗体(8株混合后)划线

      3号抗体(4F4 )标记配对4号抗体(5D2)划线

      3号抗体(4F4 )标记配对8号抗体(8株混合后)划线


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