非洲猪瘟单抗制备及配对测试初步调试
非洲猪瘟单抗制备实验进程
1、免疫时间计划表
实验进程 | 日期 |
初免 | 2021.03.26 |
二免 | 2021.04.02 |
三免 | 2021.04.09 |
四免 | 2021.04.16 |
融合 | 2021.04.19 |
筛选 | 2021.04.26 |
亚一筛选 | 2021.05.02 |
亚二筛选 | 2021.05.08 |
亚三筛选 | 2021.05.14 |
腹水 | 2021.05.23 |
2、二免效价、抗体特异性
加入免疫抗体100μL /孔, 轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应20min。小心揭开盖板膜,将孔内液体甩干,加入洗涤工作液250μL/孔,每次静置20s,甩去孔内液体,重复洗涤3次,一次用吸水纸拍干。再加入酶标物100μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应20min。小心揭开盖板膜,将孔内液体甩干,加入洗涤工作液250μL/孔,每次静置20s,甩去孔内液体,重复洗涤3次,用吸水纸拍干。加入底物液A液50μL/孔,再加底物显色液B液50μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。
结果及结论见下表:
| Ag 500倍 | Ag 1k倍 |
1-Ab 500倍 | 4.71 | 4.28 |
1-Ab 5k倍 | 3.58 | 3.12 |
2-Ab 500倍 | 4.52 | 3.97 |
2-Ab 5k倍 | 2.45 | 2.01 |
结论 | 1、Ag包被浓度为3K倍。 |
2、二免效价较高。 |
3、筛选效价
3.1 筛选效价
加入酶标物50μL /孔, 再加入细胞上清50μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜,将孔内液体甩干,加入洗涤工作液250μL/孔,每次静置20s,甩去孔内液体,重复洗涤3次,用吸水纸拍干。加入底物液A液50μL/孔,再加底物显色液B液50μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。结果见下图:
结论:共选62个阳性孔的细胞进行抗体特异性测定。
3.2 筛选抗体特异性
加入酶标物50μL /孔, 再加入细胞上清50μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜,将孔内液体甩干,加入洗涤工作液250μL/孔,每次静置20s,甩去孔内液体,重复洗涤3次,用吸水纸拍干。加入底物液A液50μL/孔,再加底物显色液B液50μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。结果见下图:
结论:共选出14株效价高、抗体特异性好的细胞进行亚克隆。
株号有:2C四 3B9 3D6 3F10 4D1 4F4 5D2
5D4 5D7 7D4 7D7 7C8 8G10 4F10
4、亚一筛选效价
加入酶标物50μL /孔, 再加入细胞上清50μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜,将孔内液体甩干,加入洗涤工作液250μL/孔,每次静置20s,甩去孔内液体,重复洗涤3次,用吸水纸拍干。加入底物液A液50μL/孔,再加底物显色液B液50μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。
结论:共选出10株效价高的细胞进行第二次亚克隆。
株号有:2C四 3D6 3F10 4F4 5D2 5D4 5D7 7D4 8G10 4F10
5、亚二筛选效价
加入酶标物50μL /孔, 再加入细胞上清50μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜,将孔内液体甩干,加入洗涤工作液250μL/孔,每次静置20s,甩去孔内液体,重复洗涤3次,用吸水纸拍干。加入底物液A液50μL/孔,再加底物显色液B液50μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。
结论:经显微镜观察,有四株细胞纯阳性(5D2 5D4 5D7 3F10)扩大并冻存; 有六株细胞细胞进行第三次亚克隆。
三次亚克隆株号有:2C四 3D6 4F4 7D4 8G10 4F10
6、亚三筛选效价
加入酶标物50μL /孔, 再加入细胞上清50μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜,将孔内液体甩干,加入洗涤工作液250μL/孔,每次静置20s,甩去孔内液体,重复洗涤3次,用吸水纸拍干。加入底物液A液50μL/孔,再加底物显色液B液50μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。
结论:经显微镜观察,有四株细胞纯阳性(8G10 2C四 4F4 7D4 )扩大并冻存;
4F10和3D6株细胞转阴性,扔之。
7.腹水效价
将筛选到的非洲猪瘟8株单抗,制备腹水并测腹水效价。
加入酶标物50μL /孔, 再加入稀释后的抗体50μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜,将孔内液体甩干,加入洗涤工作液250μL/孔,每次静置20s,甩去孔内液体,重复洗涤3次,一次用吸水纸拍干。加入底物液A液50μL/孔,再加底物显色液B液50μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。
结果及结论见下表:
细胞株 | Ab-5w | Ab-10W | 效价 |
2C四 | 3.98 | 3.17 | >10w |
3F10 | 3.29 | 1.63 | >10w |
4F4 | 3.54 | 1.55 | >10w |
5D2 | 4.37 | 2.11 | >10w |
5D4 | 3.54 | 1.62 | >10w |
5D7 | 3.96 | 1.91 | >10w |
7D4 | 4.19 | 2.54 | >10w |
8G10 | 1.36 | 0.84 | 10w |
结论 | 非洲猪瘟筛选到8株单克隆抗体,腹水效价10w以上。 |
非洲猪瘟单抗配对初步测试
ASFV共8株Ab,各按生产条件标记1条金垫后测试结果
标记:1号.2C四 2号.3F10 3号.4F4 4号.5D2 5号.5D4 6号.7D4 7号.8G10 8号.混合 9号.兔多抗
划线:用9株Ab同时划9种T线,1/1稀释.稀释液是动物CB液
(一) 金垫标记:1-8号单抗;T线:兔多抗划线1:1(动物包被液稀释);
先用 1-8号金条和兔多抗1:1 划线测试阳性病料(1:5,用2*样稀稀释,非处理样品垫),如图1,8-10分观察,结论:爬速过快,需要调整爬速。
接着用 1-8号金条和兔多抗1:1 划线测试阳性病料(1:5,用1*样稀稀释,非处理样品垫),8-10分观察,如图2
结论如下表:
1-8号金条与兔多抗1:1 测试阳性结果
| 1号金垫 | 2号金垫 | 3号金垫 | 4号金垫 | 5号金垫 | 6号金垫 | 7号金垫 | 8号金垫 |
划线兔多抗1:1 | + | + | +- | + | ++ | - | - | + |
继续优化实验方案,用 1-8号金条和兔多抗1:1 分别测试阳性病料(1:5,用1*样稀稀释,用滤血膜)和猪阴性血清(1:5,用1*样稀稀释),8-10分观察,分别如图3和图4
多次实验结论:1,2,3,4,5,8,号抗体与兔多抗(1:1)反应,6,7号抗体与兔多抗(1:1)无反应。并重复复核实验1,2,3,4,5,8,这六种抗体与兔多抗的反应,如图5,证明结论正确。
(二) 颠倒测试,金垫标记:9号兔多抗标记;T线:1,2,3,4,5,8号单抗1:1(动物包被液稀释);
阳性见图6,阴性见图7。 结论1,2号抗体好。
9号兔多抗标记金条与1,2,3,4,5,8号抗体划线测试阴阳性结果
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| 1号Ab划线 | 2号Ab划线 | 3号Ab划线 | 4号Ab划线 | 5号Ab划线 | 8号Ab划线 |
兔多抗标记的金垫 | 阳性 | + | + | + | + | + | + |
阴性 | +--- | +--- | +-- | +- | +- | +- |
(三) 对摸索到的六株单抗进行交叉配对测试(1号.2C四 2号.3F10 3号.4F4 4号.5D2 5号.5D4 8号.混合)
(1)1号抗体标记金条,依次为2 3 4 5 8号抗体1:1划线,测试阳性(病料1:5稀释,用1*样稀),见图8.测试阴性(猪血清1:5,用1*样稀),结果见图9
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| 2号Ab划线 | 3号Ab划线 | 4号Ab划线 | 5号Ab划线 | 8号Ab划线 |
1号抗体标记的金垫 | 阳性 | +- | + | + | + | + |
阴性 | +-- | +- | +-- | +-- | +-- |
(2)2号抗体标记金条,依次为1 3 4 5 8号抗体1:1划线,测试阳性(病料1:5稀释,用1*样稀),见图10.测试阴性(猪血清1:5,用1*样稀),结果见图11
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| 1号Ab划线 | 3号Ab划线 | 4号Ab划线 | 5号Ab划线 | 8号Ab划线 |
2号抗体标记的金垫 | 阳性 | + | ++ | + | + | ++ |
阴性 | +-- | +- | +-- | +-- | +- |
(3)3号抗体标记金条,依次为1 2 4 5 8号抗体1:1划线,测试阳性(病料1:5稀释,用1*样稀),见图12.测试阴性(猪血清1:5,用1*样稀),结果见图13
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| 1号Ab划线 | 2号Ab划线 | 4号Ab划线 | 5号Ab划线 | 8号Ab划线 |
3号抗体标记的金垫 | 阳性 | + | + | ++ | + | ++ |
阴性 | +-- | +-- | +-- | +-- | +- |
(4)4号抗体标记金条,依次为1 2 3 5 8号抗体1:1划线,测试阳性(病料1:5稀释,用1*样稀),见图14.测试阴性(猪血清1:5,用1*样稀),结果见图15
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| 1号Ab划线 | 2号Ab划线 | 3号Ab划线 | 5号Ab划线 | 8号Ab划线 |
4号抗体标记的金垫 | 阳性 | + | + | ++ | + | + |
阴性 | +- | +-- | +- | +- | +- |
(5)5号抗体标记金条,依次为1 2 3 4 8号抗体1:1划线,测试阳性(病料1:5稀释,用1*样稀),见图16.测试阴性(猪血清1:5,用1*样稀),结果见图17
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| 1号Ab划线 | 3号Ab划线 | 4号Ab划线 | 5号Ab划线 | 8号Ab划线 |
2号抗体标记的金垫 | 阳性 | +- | ++ | + | + | ++ |
阴性 | +-- | +-- | +- | +-- | +- |
(6)8号抗体标记金条,依次为1 2 3 4 5号抗体1:1划线,测试阳性(病料1:5稀释,用1*样稀),见图18.测试阴性(猪血清1:5,用1*样稀),结果见图19
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| 1号Ab划线 | 2号Ab划线 | 3号Ab划线 | 4号Ab划线 | 5号Ab划线 |
8号抗体标记的金垫 | 阳性 | ++ | + | ++ | + | + |
阴性 | +-- | +-- | +- | +-- | +- |
结论:经重复观察实验,以下四组单抗交叉配对效果较好。
2号抗体(3F10)标记配对3号抗体(4F4 )划线
2号抗体(3F10)标记配对8号抗体(8株混合后)划线
3号抗体(4F4 )标记配对4号抗体(5D2)划线
3号抗体(4F4 )标记配对8号抗体(8株混合后)划线