Tunel即原位末端转移酶标记技术。
凋亡细胞的DNA双链断裂或一条链出现缺口,产生一系列3'-OH末端,在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)作用下,将脱氧核糖核苷酸和生物素所形成的衍生物标记到DNA的3末端,从而进行凋亡细胞的检测。
Tunel是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征。
客户须知：
1.客户须在实验开始前确保其提供材料的数量和质量,并提供相关信息;
2.Tunel凋亡检测试剂盒可以由客户提供,也可以由本公司代购;
3.客户提供相应的组织切片,提供的切片组织面积应≤1cm2 ;
4.寄送切片时选择纸盒包装完好,周围加以泡沫或纸巾填塞以免路途损坏,常温寄送即可;
5.客户应对所提供的材料及信息负责,如因客户提供的材料及信息不准确而引|起的实验延误或经济损失由客户承担。
TUNEL染色步骤
1.用有机试剂浸洗2次，每次5min；
2.用梯度乙醇（100、95、90、80、70％）各浸洗1次，每次3min；
3.PBS漂洗2次；
4.用Proteinase K工作液处理组织15-30 min 在21–37°C或者加细胞通透液8min；
5.PBS漂洗2次；
6.制备TUNEL反应混合液，处理组用50μl TdT＋450μl 荧光素标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100μl DNase 1，反应在室温～37℃×10～30min，后面步骤同处理组。
7. 玻片干后，加50μl TUNEL反应混合液（阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×60min。
8.PBS漂洗3次；
9.可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为450～500nm，检测波长为515～565nm）
10.玻片干后加50μl converter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。
11.PBS漂洗3次；
12.在组织处加50～100μlDAB底物，反应15～25℃×10min；
13.PBS漂洗3次；
14.拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、有机试剂透明、中性树胶封片。
15.加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜进行计数（200～500个细胞）并拍照。