Hifair? T7 High Yield RNA Synthesis Kit
产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 价格（元） |
Hifair? T7 High Yield RNA Synthesis Kit | 10623ES50 | 50 T | 1785 |
10623ES60 | 100 T | 3385 |
产品描述
Hifair? T7 High Yield RNA Synthesis Kit进行了转录反应的优化，试剂盒使用T7 RNA聚合酶并以含有T7 启动子序列的线型双链DNA为模板，以NTPs为底物，对启动子下游的DNA序列进行转录，Gaoxiao合成单链RNA。转录时可在底物中加入修饰的核苷酸，制备生物素或染料标记的RNA。
本试剂盒可以合成长转录本以及短转录本，以1 μg的模板投入量可以产生100-200 μg的RNA，转录合成的RNA可用于诸如RNA结构与功能研究、RNA酶保护、探针杂交、RNAi、显微注射及体外翻译等多方面的下游应用。
产品组分
编号 | 组分 | 产品编号/规格 |
10623ES50 (50 T) | 10623ES60 (100 T) |
10623-A | T7 RNA Polymerase Mix | 100 μL | 200 μL |
10623-B | 10×Transcription Buffer | 100 μL | 200 μL |
10623-C | ATP（100mM） | 100 μL | 200 μL |
10623-D | CTP（100mM） | 100 μL | 200 μL |
10623-E | GTP（100mM） | 100 μL | 200 μL |
10623-F | UTP（100mM） | 100 μL | 200 μL |
10623-G | Control DNA Template（500ng/μL） | 10 μL | 20 μL |
产品应用
RNA体外合成
运输储存方法
干冰运输。-20℃保存，有效期两年。
注意事项
1. 反应中须严格注意不要混入RNase。
2. 实验器材（如：枪头、产品管等）注意严格使用 RNase Free用品。
3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
合成原理
图1：RNA体外转录过程
图1：RNA体外转录过程
操作流程
1.DNA模板制备
带有双链T7启动子的线性化质粒或PCR扩增产物都可以作为Hifair? T7 High Yield RNA Synthesis Kit 体外转录模板，模板可以用TE缓冲液或Rnase free H2O溶解。
T7启动子序列： TAATACGACTCACTATAG*GG （注：G*为RNA转录的个碱基）
A.质粒模板
将目的DNA插入含有T7启动子的质粒载体中，然后用限制酶进行处理，待完全线性化后进行纯化。
注：1. 环状质粒由于没有有效的终止，会转录出不同长度的RNA产物，为了得到特定长度的RNA，质粒必须完全线性化。
2. 质粒线性化所选限制酶需要在启动子区域右侧、插入DNA片段的下游，且在插入DNA片段中无识别位点。选择的限制酶要能形成5’突出或者平滑末端。
3. 为了避免蛋白及盐离子等对的影响，质粒线性化后建议纯化后再作为模板进行体外转录。
图2：线性化质粒为模板体外转录过程
B.PCR产物模板
带T7启动子的PCR产物可以作为体外转录模板。首先将T7启动子序列(TAATACGA CTCACTATAGGG)加在有义链的上游引物的5’端，然后在高保真酶的作用下扩增含T7启动子的DNA模板，随后进行转录。PCR产物可以不经纯化直接作为模板，但纯化后会得到更高的RNA产出。
注：1. PCR产物作为模板，必须电泳确认产物的特异性及浓度，建议20μL反应投入2-5μL PCR产物。
2. 为了得到更多高品质的RNA，推荐PCR产物胶回收之后再作为模板进行体外转录。
2.RNA体外转录
A. 试剂解冻
将T7 RNA Polymerase Mix短暂离心，置于冰上。解冻10×Transcription Buffer和核糖核苷酸（ATP、CTP、GTP、UTP），混匀并离心至管底，10×Transcription Buffer置于室温，4种核糖核苷酸置于冰上，备用。
B. 室温装配转录反应
按下列配制反应
组分 | 体积（μL） | 终浓度 |
RNase free H2O | Up to 20 | - |
10×Transcription Buffer | 2 | 1× |
CTP / GTP/ ATP/ UTP (100 mM each) | 2 each | 10 mM each |
模板DNA | 1 μg | - |
T7 RNA Polymerase Mix | 2 | - |
注： 1. 反应于室温配置。由于10×Transcription Buffer中含有亚精胺，低温下亚精胺浓度过高会引起DNA模板沉淀。
2. 短转录本（<100nt），模板可使用2ug，转录时间增至4-8个小时。
3. 长转录本（>1000nt），建议使用质粒线性化模板进行转录。
4. 建议在PCR仪中进行反应，热盖打开，防止长时间导致反应液蒸发。
5. 反应产物可能有白色沉淀。这是反应过程中游离的焦磷酸与反应液中的镁离子形成焦磷酸镁，不影响后续实验。如想去除，添加EDTA即可消失。添加EDTA如果影响后续实验，也可以离心回收上清。
6. 使用试剂、容器等无RNase污染。
C. 37℃孵育2个小时
将上述反应液混合均匀，短暂离心至管底，37℃孵育2个小时。若转录本长度小于100nt，增加反应时间至4-8个小时。
D. DNaseⅠ处理（可选）
反应完成后，每管加入2μL DNaseⅠ（RNase free），37℃孵育15min以去除模板DNA。
3.产物纯化
转录后的RNA可以选用RNA Cleaner磁珠进行纯化（货号：12602），也可以采用酚/氯仿纯化法，氯化锂沉淀法或柱纯化等，以去除蛋白、游离的核苷酸。纯化后的RNA经电泳检测后可进行下游实验或存储于-80℃。
A.RNA Cleaner磁珠纯化法
提前将RNA clean beads从4 ℃取出，平衡至室温（约30 min），并用RNase free H2O将转录产物稀释至50μL。
①颠倒或涡旋振荡使磁珠充分混匀，吸取2×磁珠（100μL）加入RNA样品中（50μL），用移液器吹打6次充分混匀。室温孵育5 min，使RNA结合到磁珠上。
②将样品置于磁力架上5 min，待溶液澄清后，小心移除上清。
③保持样品置于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 s，小心移除上清。重复此操作一次。
（注：漂洗时使用的80%乙醇需要使用RNase free H2O新鲜配制，以防止引入RNase酶导致RNA降解。）
④保持样品始终处于磁力架上，开盖空气干燥磁珠5 min。
（注：磁珠开盖晾干时要避免过分干燥，如果磁珠出现龟裂，则提示磁珠过分干燥，此时RNA的洗脱效率会降低）。
⑤将样品从磁力架上取出，加入22μL RNase free H2O，用移液器吹打6次以充分混匀，室温静置5 min。
⑥将样品置于磁力架5 min，待溶液澄清后，小心转移上清20μL至一个新的RNase free PCR管中。
（注：建议转移上清时留2-3μL液体，以免吸到磁珠影响后续实验。得到的RNA极不稳定，建议尽快进入下一步。若要保存，请置于-80℃保存。）
B.酚/氯仿纯化法
①向20μL反应混合物中，加入115μL RNase free H2O和l5μL 3M乙酸钠（pH5.2），混合均匀。
②用等体积的酚/氯仿（1:1）抽提一次，再用等体积的氯仿抽提2次，收集上清，并转移至新的RNase free EP管中。
③加入2倍体积的无水乙醇沉淀RNA。混合均匀后置于-20℃至少30min，以转速，4℃离心15min，收集沉淀。
④加入500μL冰预冷的70%乙醇洗涤RNA沉淀。
⑤ 用20μL RNase free H2O溶解RNA沉淀。纯化后的RNA溶液于-80℃保存。
C.氯化锂沉淀法
采用氯化锂沉淀法，RNA长度要大于300nt，且浓度不能低于100ng/μL。
①向20μL反应混合物中，加入30μL RNase free H2O和30μL7.5M氯化锂。
②混合均匀后，置于-20℃至少30min，以转速，4℃离心15min，收集沉淀。
③加入500μL冰预冷的70%乙醇洗涤RNA沉淀。
④ 用20μL RNase free H2O溶解RNA沉淀。纯化后的RNA溶液于-80℃保存。
D.柱纯化法
纯化前加入80μL RNase free H2O将产物稀释至100μL，再按柱纯化说明书进行纯化。
4.RNA定量
A.紫外吸收法
游离核苷酸会影响定量的准确性，采用此方法前请先进行RNA纯化。然后通过测定产物的A260读数来确定RNA的产量。对于单链RNA，1 A260相当于40μg/mL，所以RNA的产量可以如下计算： A260 x 稀释倍数 x 40 = μg/mL RNA
B.染料法
用RiboGreen染料进行RNA定量，游离核苷酸不会影响定量，可以对纯化或未纯化的反应产物中的RNA进行准确定量。
5.RNA大小及质量检测
A.琼脂糖电泳法
为了确定RNA的大小，完整度以及质量，需要进行琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。
B.Agilent 2100 Bioanalyzer检测法
2100可以用来评估RNA完整度及质量，它仅需要少量的RNA进行分析，高品质的RNA在电图上应呈现明显且锐利的峰。
常见问题及解决方案
1.转录产物产量低
模板的质量与产量密切相关，实验组产量明显低于对照组可能原因有：①实验模板中有抑制反应成分；②实验模板本身原因。
建议： ①重新纯化模板；②确定模板定量以及其完整性；③延长反应时间；④加大模板投入量；⑤尝试其它的启动子和RNA聚合酶。
2.短转录本产量低
转录起始片段短会抑制反应，转录产物小于100nt时，延长反应时间至4-8小时或增加模板量至2ug可以提高RNA产量。
3.RNA转录长度大于预期
如果电泳显示产物条带大于预期大小，可能原因：①质粒模板可能没有完全线性化；②有义链3’端为突出结构；③RNA存在未完全变性的二级结构。
建议：①检查模板是否完全线性化，如有必要，额外进行线性化；②选择合适的限制性酶，避免产生3’突出端，或者用Klenow Fragment或T4 DNA聚合酶补齐后，再进行转录；③使用变性胶检测RNA产物。
4.RNA转录长度小于预期
如果电泳显示产物条带小于预期大小，可能原因：①模板包含类似于T7 RNA聚合酶的终止序列；②模板中GC含量高。
建议：①降低反应温度（比如，30℃），有时降低温度可以增加转录长度，但会降低产量。或者尝试不同的RNA聚合酶进行转录；②若模板GC含量高，采用42℃进行转录反应，或者添加SSB提高产量及转录长度。
5.转录产物电泳拖尾
电泳过程中有拖尾现象，可能原因：①实验操作过程被RNase污染；②DNA模板被RNase污染。
建议：①实验过程中使用RNase-free的枪头和EP管，佩戴一次性乳胶手套和口罩，所有试剂均用RNase free H2O配制。②重新纯化模板DNA。
HB200916