Hieff TransTM in vitro siRNA/miRNA Transfection Reagent
Hieff TransTM siRNA/miRNA体外转染试剂
产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 价格（元） |
Hieff TransTM in vitro siRNA/miRNA Transfection Reagent Hieff TransTM siRNA/miRNA体外转染试剂 | 40806ES01* | 0.1 mL | 372.00 |
40806ES02* | 0.5 mL | 1472.00 |
40806ES03* | 1.0 mL | 2572.00 |
产品描述
Hieff TransTM siRNA/miRNA体外转染试剂是一种非脂质体PEI阳离子、两性分子转染试剂，为siRNA转染到哺乳动物细胞中而开发。适用于siRNA和miRNA的转染。这种转染试剂包裹siRNA或miRNA形成阳离子复合物，该复合物与细胞表面带负电的蛋白聚糖相互作用吸附在细胞表面，通过内吞进入细胞，形成内含体。该转染试剂具有质子海绵的作用，能够吸收溶酶体中的H+，质子的不断流入，导致复合体肿胀破裂，从而使外源siRNA或miRNA释放到细胞质中。
该产品可在广泛的细胞系中，实现1 nM的siRNA超过90%的表达效率，避免了脱靶效应。适用于多种细胞转染，包括Hela、MCF-7、HepG2、CHO等贴壁细胞；以及难以转染的悬浮细胞系，如K562或THP-1细胞，可达到80%的沉默效率；同时还包括一些原代细胞，原代人成纤维细胞和原代人肝细胞等，可达到80%的沉默效率。
运输与保存方法
冰袋（wet ice）运输。产品4 oC保存，一年有效。不可冷冻！
注意事项
1）整个实验过程使用无RNA酶和无热原性的材料，如离心管、枪头、缓冲液。
2）转染前，确保siRNA是经过PAGE纯化和脱盐处理过的，高纯度的siRNA或者miRNA有助于获得较高的转染效率。
3）PEI阳离子转染试剂应该在4 oC保存，要注意避免多次反复长时间开盖，否则可能会导致PEI挥发，降低转染效率。
4）转染前一天，确保接种贴壁细胞密度在30%-50%左右，对于一些小细胞和生长缓慢的细胞，接种密度可适当扩大2倍。
5）转染前，确保siRNA/miRNA基因沉默表达不会影响细胞活力。
6）该产品只适合体外转染，不能用于体内转染。
操作流程
一．贴壁细胞转染（以24孔板和转染1 nM siRNA为例，其他培养板加样体积请参考表1）
接种贴壁细胞
1.为了提高转染效率，建议在转染前一天接种细胞，接种细胞密度建议30%-50%左右，建议初次使用时设置梯度进行优化最佳使用量。
2.按照以下系配制siRNA-PEI或miRNAPEI子核酸转染试剂阳离复合物：
1）对于每孔细胞，使用100 μL无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释8.4 ng siRNA (0.6 pmoles)，混匀。
2）立刻向100 μL的siRNA中加入2 μL的转染试剂，旋涡10秒，充分混匀。
3）在室温下孵育10 min，使得形成siRNA-PEI阳离子核酸转染试剂复合物。
【注】：孵育时间不要超过30min
4）在形成复合物过程中，移除细胞生长培养基，每孔中加入500 μL新鲜预热的完全培养基。
5）直接将100 μL siRNA-PEI阳离子核酸转染试剂复合物加入细胞中，摇动培养板，轻轻混匀。最终体积为600 μL ，siRNA终浓度为1 nM。
6）37 ℃，5% CO2培养箱培养，直至目的基因表达。建议一般mRNA表达水平通常在24-72 h，蛋白表达水平在48-96 h。
图1 转染贴壁细胞操作流程
【注】：由于靶基因、细胞类型、siRNA效价、靶mRNA的半衰期和靶蛋白的周转率等因素，均会影响siRNA的转染效率。建议选取siRNA浓度在1 nM到10 nM之间。转染试剂的体积应根据siRNA浓度和培养皿的大小进行调整，请参见下表1。
表1 siRNA终浓度为1 nM时，转染试剂、培养基的用量参考值
培养皿 | siRNA物质的量(pmoles) | 每孔siRNA的含量（ng） | siRNA转染试剂体积（μL） | 形成PEI-siRNA复合物的体积（μL） | 完全培养基的体积（含血清+双抗） | 加入复合物后，细胞培养基总体积 |
96孔板 | 0.17 | 2.4 | 0.7-0.8 | 50 | 125 μL | 175 μL |
24孔板 | 0.6 | 8.6 | 1-3 | 100 | 500 μL | 600 μL |
12孔板 | 1.2 | 17 | 2-6 | 200 | 1 mL | 1.2 mL |
6孔板 | 2.2 | 31 | 4-12 | 200 | 2 mL | 2.2 mL |
25cm2培养瓶 | 4.4 | 62 | 10-20 | 400 | 4 mL | 4.4 mL |
75cm2培养瓶 | 10.5 | 147 | 30-50 | 500 | 10 mL | 10.5 mL |
表2 siRNA终浓度为10 - 50 nM时，转染试剂、培养基的用量参考值
培养皿 | siRNA转染试剂体积（μL） | 形成复合物的体积（无血清培养基）（μL） | 完全培养基的体积（含血清+双抗） | 加入复合物后，细胞总体积 |
96孔板 | 0.5-1.5 | 50 | 125 μL | 175 μL |
24孔板 | 2-4 | 100 | 500 μL | 600 μL |
12孔板 | 4-8 | 200 | 1 mL | 1.2 mL |
6孔板 | 8-16 | 200 | 2 mL | 2.2 mL |
25cm2培养瓶 | 15-25 | 400 | 4 mL | 4.4 mL |
二．悬浮细胞转染（以24孔板和转染5 nM siRNA为例，其他培养板加样体积请参考表4）
接种细胞
1.为了优化悬浮细胞转染条件，与贴壁细胞相比，需要降低悬浮细胞的培养基的体积。根据培养皿大小和完整培养基的体积，推荐的接种悬浮细胞的数量如下表3所示。
表3 转染当天，根据培养皿的大小，接种悬浮细胞数量参考值
培养皿 | 底面积(cm2) | 每孔接种细胞悬浮液体积（μL） | 转染当天接种细胞数 |
384孔板 | 0.1 | 25 | 5 ×103~1×104 |
96孔板 | 0.32 | 50 | 1×104~ ×104 |
24孔板 | 2 | 200 | 1×105 ~ 2×105 |
12孔板 | 4.5 | 500 | 2×105 ~ 4×105 |
6孔板 | 9.6 | 1000 | 5×105 ~ 2×106 |
25cm2培养瓶 | 25-28 | 2000 | 2×106~ 5×106 |
2.按照以下系配制siRNA-PEI阳离子核酸转染试剂复合物：
1）对于每孔细胞，使用100 μL无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释21 ng siRNA (1.5 pmols)，混匀。
2）向100 μL的siRNA中加入4 μL的转染试剂，立刻旋涡10秒，充分混匀。
3）在室温孵育15 min，使得形成siRNA-PEI阳离子核酸转染试剂复合物。
【注】：孵育时间不要超过30 min
4）在每孔200 μL细胞悬浮液中，加入100 μL的siRNA-PEI阳离子核酸转染试剂复合物，轻轻混匀。最终体积为300 μL，siRNA终浓度为5 nM。
5）37 ℃，5% CO2培养箱培养4-6 h后，再加入700 μL完全培养基，轻轻摇动培养板使其混匀。
6）继续放入培养箱中孵育，直至目的基因表达。建议一般mRNA表达水平通常在24-72 h，蛋白表达水平在48-96 h。
【注】：为了优化内源性基因沉默，建议选取siRNA浓度在5 nM到20 nM之间。转染试剂的体积应根据siRNA浓度和培养皿的大小进行调整，请参见下表4。
表4 siRNA浓度为5 nM时，在悬浮细胞中的参考值
培养皿 | siRNA的浓度(pmoles) | 每孔siRNA的含量（ng） | 转染试剂体积（μL） | 形成复合物培养基体积（μL） | 悬浮细胞的体积 | 转染4-6h后另加入培养基的体积 |
384孔板 | 0.25 | 3.75 | 1 ± 0.5 | 25 | 25 μL | 0 μL |
96孔板 | 0.5 | 7.5 | 2 ± 1 | 50 | 50 μL | 100 μL |
24孔板 | 1.5 | 21 | 3 ± 2 | 100 | 200 μL | 700 μL |
12孔板 | 3.5 | 49 | 6 ± 4 | 200 | 500 μL | 1 mL |
6孔板 | 6 | 84 | 10 ± 8 | 200 | 1 mL | 2 mL |
25cm2培养瓶 | 12 | 168 | 15 ±10 | 400 | 2 mL | 4 mL |
表5 悬浮细胞中siRNA浓度、转染试剂的用量参考值
培养皿 | siRNA的终浓度/孔（nM） | 转染试剂的体积/孔（μL） |
96孔板 | 1 ~ 20 | 1 ± 0.5 |
24孔板 | 2 ± 1 |
12孔板 | 3 ± 2 |
6孔板 | 10 ± 8 |
96孔板 | 20 ~ 50 | 1.5 ± 0.5 |
24孔板 | 3 ± 1 |
12孔板 | 5 ± 2 |
6孔板 | 15 ± 8 |
三．miRNA转染操作流程
该转染试剂也适合转染miRNA，转染贴壁细胞和悬浮细胞的具体操作请参考siRNA的操作流程。
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40806ES03* | 1.0 mL | 2572.00 |
HB200716