Hieff NGS? Ultima DNA Ligation Module
快速DNA连接模块
产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 价格(元) |
Hieff NGS? Ultima DNA Ligation Module 快速DNA连接模块 | 12604ES24 | 24 T | 3263.00 |
12604ES96 | 96 T | 10863.00 |
12604ES98 | 960T | 87663.00 |
产品描述
Hieff NGS? Ultima DNA Ligation Module是针对Illumina?与MGI?高通量测序平台文库构建专业设计的DNA连接模块,其中最大的亮点为本产品采用一款我公司自主研发的高效连接酶Fast T4 DNA ligase。本产品可在双链平末端DNA片段或双链3′-dA DNA片段的两端连接Illumina?与MGI?测序平台适用的DNA接头,具有连接效率高、简便、可实现自动化等优势。
本产品已与Hieff NGS? Ultima Endperp Mix(Cat#12605),2×Super Canace? II High-Fidelity Mix for Library Amplification(Cat#12621)共同用于DNA文库构建,通过Illumina?高通量平台测序验证其有效性。
本产品已与Hieff NGS? Ultima Endprep Mix(Cat#12605)、2×Ultima HF Amplification Mix for MGI?(Cat#13344)共同用于DNA文库构建,通过MGI?高通量平台测序验证其有效性。
本产品中提供的所有试剂组分,都经过严格的质量与功能验证,最高程度保障产品优异性能与批间稳定性。
产品组分
产品编号 | 组分名称 | 产品编号/规格 |
12604ES24 | 12604ES96 | 12604ES98 |
12604-A | Fast T4 DNA Ligase | 120 μL | 480 μL | 4.8 mL |
12604-B | 5×Fast Ligation Buffer | 480 μL | 960×2 μL | 9.6×2 mL |
质量控制
Fast T4 DNA Ligase
1. SDS-PAGE纯度:>95%。
2. 16小时孵育检测:50 μL反应体系中包含5μl本酶和1 μg Hind III-λDNA,37°C下孵育16小时。经琼脂糖凝胶电泳检
测,条带无降解;50 μL反应体系中包含5μl本酶和1 μg T3 DNA,37°C下孵育16小时。经琼脂糖凝胶电泳检测,条
带无降解。
3. RNase活性:5 μl本酶中加入40 ng FAM-RNA及,37°C下孵育16小时。经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,条带无降解。
4. 核酸内切酶活性:50 μL反应体系中加入5 μl本酶和1 μg φX174 RF I DNA,37°C下孵育4小时。经琼脂糖凝胶电泳
检测,RF II转化比率<10%。
5. 核酸外切酶活性:50 μL反应体系中加入至少5 μl本酶和1 μg声振的[3H]DNA(105 cpm/μg),37°C下孵育4小时,
释放的放射性<0.1%。
6. 功能活性(平末端连接):50 μL反应体系,在1×Fast Ligation Buffer中,加入0.5 μL Fast T4 DNA Ligase,18 μg
Hae III φX174,16°C孵育7.5分钟。经琼脂糖电泳检测,片段连接率>95%。
7. 功能活性(接头连接):50 μL反应体系,在1×Fast Ligation Buffer中,加入0.125 μL Fast T4 DNA Ligase,8 nmol
12 bp接头,16°C孵育过夜。经琼脂糖电泳检测,无明显未连接接头。
Fast Ligation Buffer
1. 16小时孵育检测:50 μL反应体系中包含1×Fast Ligation Buffer和1 μg Hind III-λDNA,37°C下孵育16小时。经琼
脂糖凝胶电泳检测,条带无降解;50 μL反应体系中包含1×Fast Ligation Buffer和1 μg T3 DNA,37°C下孵育16小时。
经琼脂糖凝胶电泳检测,条带无降解。
2. 核酸内切酶活性:50 μL反应体系中包含1×Fast Ligation Buffer和1 μg φX174 RF I DNA,37°C下孵育4小时。经
琼脂糖凝胶电泳检测,RF II转化比率<10%。
3. RNase活性:在1×Fast Ligation Buffer中加入40 ng FAM-RNA,37°C下孵育16小时。经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,
条带无降解。
4. 磷酸酶活性检测:在磷酸酶活性检测缓冲液中加入1×Fast Ligation Buffer和2.5 mM对硝基苯磷酸,37°C下孵育4
小时。经光谱测定法检测,405 nm处无对硝基苯阴离子特征吸收峰。
运输与保存方法
冰袋运输。
-20℃保存,效期一年。
注意事项
为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用方法
1. Adapter的质量和使用浓度直接影响连接效率及文库产量。Adapter用量过高可能会产生较多Adapter Dimer;用量较低可能会影响连接效率及文库产量。表1列举了使用本试剂盒,不同Input DNA量推荐的Adapter使用量。
表1 500 pg-1 μg Input DNA推荐的Adapter使用浓度
Input DNA | Adapter : Input DNA摩尔比 | Input DNA | Adapter : Input DNA摩尔比 |
1 μg | 10:1 | 50 ng | 100:1 |
500 ng | 20:1 | 25 ng | 200:1 |
250 ng | 40:1 | 1 ng | 200:1 |
100 ng | 100:1 | 500 pg | 400:1 |
【注】:Input DNA摩尔数(pmol)≈ Input DNA质量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均长度(bp)]。
2. 目前主流的合并法DNA建库试剂盒,其末端修复和加A处理后一般不纯化,直接进行接头连接。本试剂盒可与主流的商业化末端修复加A体系兼容,进行接头连接。反应体系请参考如下配制,涡旋瞬离后置于20℃,反应15分钟即可。
表2 Adapter Ligation体系
名称 | 体积(μL) |
dA-tailed DNA | 60 |
5×Fast Ligation Buffer | 20* |
Fast T4 DNA Ligase | 5 |
DNA Adapter | X** |
ddH2O | To 100 |
【注】:*对于5×Fast Ligation Buffer,请上下颠倒、振荡,充分混匀并瞬时后离心使用。
**根据自身需求加入适量的接头。
【接头添加计算举例】:当Input DNA为100 ng,Input DNA长度为300 bp时,接头应该添加多少?
第一步,计算Input DNA摩尔数。公式:Input DNA摩尔数(pmol)≈ Input DNA质量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均长度(bp)];
Input DNA 摩尔数(pmol)=100÷(0.66×300)=0.5 pmol;
第二步,计算接头添加摩尔数。根据注意事项三表2查询接头添加比例;
根据表2,查得Input DNA 100ng时接头添加比例100:1,则接头添加摩尔数=100×0.5 pmol=50 pmol;
第三步,计算接头添加体积。接头浓度=15 μmol/L(如使用其他接头,浓度需要依据其他接头浓度参数);
接头添加体积=接头添加摩尔数(50 pmol)÷接头浓度(15 μmol/L)=3.34 μL(注:15 μmol/L=15 pmol/μL)
综上,接头可添加3.4 μL,加1.6 μL水补齐至5 μL。(注:接头最大加入体积不超过5 μL)
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