Hifair? V Reverse Transcriptase 第五代耐热逆转录酶
产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 价格（元） |
Hifair? V Reverse Transcriptase 第五代耐热逆转录酶 | 11300ES92 | 10000 U | 1623.00 |
Hifair? V Reverse Transcriptase 第五代耐热逆转录酶 | 11300ES93 | 50000 U | 5623.00 |
产品描述
Hifair? V Reverse Transcriptase是在Hieff? M-MLV (H-) Reverse Transcriptase基础上通过基因工程技术得到的全新逆转录酶，与Hieff? M-MLV (H-) Reverse Transcriptase相比，其热稳定性大幅度提高，可耐受高达60℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时，该酶增强了与模板的亲和力，适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。Hifair? V Reverse Transcriptase合成全长cDNA的能力也有了提升，可扩增长达10 kb的cDNA。
产品组分
编号 | 组分 | 产品编号/规格 |
11300ES92 (10000 U) | 11300ES93 (50000 U) |
11300-A | Hifair? V Reverse Transcriptase (200 μM) | 50 μL | 250 μL |
11300-B | 5×Hifair? V Buffer | 250 μL | 1.25 mL |
产品应用
一步法RT-qPCR；基因克隆；荧光定量。
活性定义
以Poly(A) .Oligo(dT)为模板-引物，在37℃，10 min内，将1 nmol的dTTP掺入为酸不溶性物质所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。
质量控制
核酸外切酶残留检测：200 U本酶和1 μg λDNA-Hind Ⅲ，37℃下孵育1 h，DNA的电泳谱带不发生变化。
核酸内切酶残留检测：200 U本酶和1 μg Supercoiled pBR322 DNA，37℃下孵育1 h，DNA的电泳谱带不发生变化。
RNase残留检测：200 U本酶和1 μg小鼠肝脏总RNA，37℃下孵育1 h，RNA电泳谱带不发生变化。
运输与保存方法
冰袋运输。-20℃保存，有效期2年。
注意事项
1）请保持实验区域洁净；操作时需穿戴干净的手套、口罩；实验所用耗材均需保证RNase free，以防止RNase污染；
2）所有操作均应在冰上进行，防止RNA降解；
3）为保证高效率逆转录，建议使用高质量的RNA样本；
4）为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
第一链cDNA合成操作步骤
1. RNA变性（此步为可选步骤，RNA变性有助于打开二级结构，可在很大程度上提高第一链cDNA的产量。）
组分 | 使用量 |
RNase free ddH2O | to 13 μL |
Oligo (dT)18 (50 μM) or Random Primers (50 μM) or Gene Specific Primers (2 μM) | 1 μL |
or 1 μL |
or 1 μL |
模板RNA | Total RNA: 1 ng -5 μg或mRNA:1 ng-500 ng |
65℃加热5 min，迅速置于冰上冷却2 min。简短离心收集反应液后，加入下表中的逆转录反应液，并轻轻吹打混匀。
2. 逆转录反应体系配制（20 μL体系）
组分 | 使用量 |
上一步的反应液 | 13 μL |
5×Hifair? V Buffer | 4 μL |
dNTP Mix (10 mM) | 1 μL |
Hifair? V Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 1 μL |
RNase inhibitor (40 U/μL) | 1 μL |
3. 逆转录程序设置
温度 | 时间 |
25℃ | 5 min |
42℃ | 15-30 min |
85℃ | 5 min |
【注】：1）当使用Random Primers时，需25℃，孵育5 min；若使用Oligo (dT)18或Gene Specific Primers，此步可省略。
2）逆转录温度：推荐使用42℃。对于高GC含量模板或者复杂二级结构的模板，可将逆转录温度提高至50-55℃。
3）85℃加热5 min，目的是使逆转录酶失活。
※ 逆转录产物可立即用于后续PCR或qPCR反应，也可-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。
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