Hieff NGS? Fast-Pace DNA Cyclization Kit for MGI?
Fast-Pace DNA环化试剂盒
产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 价格（元） |
Hieff NGS? Fast-Pace DNA Cyclization Kit for MGI? MGI?测序平台Fast-Pace DNA 环化试剂盒 | 13341ES16 | 16T | 1853.00 |
13341ES96 | 96 T | 9253.00 |
产品描述
Hieff NGS? Fast-Pace DNA Cyclization Kit for MGI?是针对MGI?高通量测序平台专门开发设计的单链环化试剂盒。本产品采用高质量的酶和经优化后的buffer组成，显著提高反应效率，使整个环化消化流程在30 min内完成。本试剂盒适用于所有连接华大标准接头的文库扩增产物，除建库试剂本身的限制外，本环化试剂盒不限MGI?测序平台。
产品组分
组分编号与名称 | 13341ES16 | 13341ES96 |
13341-A | Splint Oligo | 96 μL | 576 μL |
13341-B | Splint Buffer | 240 μL | 2×720 μL |
13341-C | Ligase | 80 μL | 480 μL |
13341-D | Digestion Buffer | 128 μL | 768 μL |
13341-E | Digestion Enzyme | 32 μL | 192 μL |
运输与保存方法
冰袋运输。
所有组分-20°C保存，有效期1年。
注意事项
一、关于操作
1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。
3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡，剧烈振荡可能会造成文库产出下降。
4. 为避免样品交叉污染，推荐使用带滤芯的枪头，吸取不同样品时请更换枪头。
5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。
6. 定时对各实验区域进行清洁（使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂进行擦拭清理），以保证实验环境的洁净度。
二、样本要求及处理
2.1样本量要求
1. 本试剂盒推荐的Input DNA量为1 pmol；若PCR产物不足，最低可降至0.5 pmol投入量。
2. 若有特殊的环化投入量需求，则按照文库制备试剂盒的要求投入所需的 Input DNA 量。
3. 不同片段大小 DNA 1 pmol 分子对应不同的质量，可根据公式 1 计算或参考表 1 选择所需的 Input DNA 量：
公式 1 PCR 产物摩尔数与质量间的换算
1 pmol PCR 产物对应的质量 (ng)=DNA 主片段大小 (bp)×0.66
表1 不同片段大小PCR产物1pmol对应产量
插入片段大小（bp） | PCR产物主片段大小（bp） | 1 pmol对应产量（ng） |
150 | 230 | 152 |
200 | 280 | 185 |
250 | 330 | 218 |
300 | 380 | 251 |
2.2 样本混样要求
1. Input DNA 可以是单个样本，也可以是多个带有不同 Barcodes 的样本的混合物。
2. 对样本进行混合时需满足 Barcodes 混合的要求，可参考表Adapters 试剂盒说明书选择合适的 Barcodes 进行混合。
3. 混合的样本总量推荐为 1 pmol，若每个样本所需数据量相同，则等量混合，每个样本所需的质量按照公式 2 进行计算：
公式 2 混合样本中单个样本所需质量的计算
单个样本所需的质量(ng)=1 pmol Input DNA 对应的质量（ng） /混合的样本个数 N
4. 单个样本或混合后样本用于环化时，体积应为 34 μL，若不足则用 ddH2O 补充至 34 μL。
三、关于磁珠纯化（Bead-based Clean Up）
1. 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致纯化得率下降。
2. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。
3. 磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。
4. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥约5 min。
5. 单链环产物纯化保存，可使用TE Buffer洗脱，产物可于-20°C可保存1个月。
四、关于文库质检（Library Quality Analysis）
1.单链环产物纯化后推荐使用 Qubit? ssDNA Assay Kit 单链 DNA 荧光染料试剂对纯化后产物进行定量。
2. 针对华大智造高通量测序平台， 单链环产物纯化后产量应≥ 80 fmol （足够2次上机测序）。
3. 可根据公式 3 计算或参考表 2 。
公式 3 单链环摩尔数与质量间的换算
80 fmol 单链环对应的质量 (ng)=0.08×DNA 主片段大小 (bp)×0.33
表2 不同PCR产物片段大小对应80fmol单链环产量
插入片段大小（bp） | PCR产物主片段大小（bp） | 80 fmol对应产量（ng） |
150 | 230 | 6.07 |
200 | 280 | 7.39 |
250 | 330 | 8.71 |
300 | 380 | 10.03 |
使用方法
一、自备材料
1. 纯化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS? DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效产品。
2. 文库质控：Cat # Q10212, Thermo fisher Qubit? ssDNA Assay Kit。
3. 其他材料：无水乙醇、灭菌超纯水、TE Buffer（10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA）、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR仪等。
二、操作流程
三、操作步骤
3.1 变性
1. 根据文库长度， 取1 pmol至0.2 mL PCR 管中，用 ddH2O 补充至 34 μL。
2. 将表3中试剂解冻后，颠倒混匀并置于冰上备用。
3. 于冰上配制表3反应体系。
表3 DNA变性体系
名称 | 体积（μL） |
单个或混合好的双链文库 | 34 |
Splint Oligo | 6 |
Total | 40 |
4. 混匀后，在 PCR 仪上进行 98℃变性 3 min，之后立即置于冰上，冰浴 2 min 后瞬时离心。
3.2 单链环化
1. 将表 4 中各试剂解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。
2. 于冰上配制表4反应体系。
表4单链环化体系
名称 | 体积（μL） |
上一步反应物 | 40 |
Splint Buffer | 15 |
Ligase | 5 |
Total | 60 |
3.使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。
4. 将PCR管置于PCR仪上，按照表5所示摄制反应程序，进行单链环化反应。
表5单链环化反应程序
温度 | 时间 |
热盖105°C | OFF |
37°C | 15min |
4°C | Hold |
★停止点1：环化反应后产物，可置于-20℃储存。
若是Input DNA类型为游离DNA文库，可在此步骤停止；可取20 μl该步骤环化产物进行下一步反应。
3.3 酶切消化
1. 将表 6 中各试剂解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。
2. 于冰上配制表6所示反应体系。
表6 酶切消化体系
名称 | 体积（μL） |
上一步反应物 | 60 |
Digestion Buffer | 8 |
Digestion Enzyme | 2 |
Total | 70 |
3. 使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。
4. 将PCR管置于PCR仪上，按照表7的条件进行反应：
表7 酶切消化反应程序
温度 | 时间 |
热盖105°C | OFF |
37°C | 10 min |
4°C | Hold |
5. 反应结束后，瞬时离心，立即进行纯化。
3.4 消化产物纯化
该步骤使用磁珠对3.3步骤的产物进行纯化。
1. 准备工作：将Hieff NGS? DNA Selection Beads或 Beckman AMPure XP Beads由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3. 吸取120 μL Hieff NGS? DNA Selection Beads至消化产物中，室温孵育10min。
4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约2 min），小心移除上清。
5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入500μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。
6. 重复步骤5，总计漂洗两次。
7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂。
8. 将PCR管从磁力架中取出，加入22 μL TE Buffer，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置10 min。
9. 短暂离心，将 PCR 管始终置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约 2min），将上清小心移至新 PCR 管中。
★停止点2：环化纯化产物，可置于-20℃储存一个月。
3.4 消化产物质控
使用Qubit? ssDNA Assay Kit荧光试剂对酶切消化产物进行定量，具体请参见注意事项四。
HB190925
