Rhod-2,AM,CellPermeable细…

Rhod-2, AM,Cell Permeable 细胞可渗透钙离子荧光探针

产品信息

产品描述

Rhod-2是一种可见光激发的高亲和力Ca²⁺指示剂，与其他可见光激发荧光探针如Fluo-3/4相比，Rhod-2具有长波长，更适用于检测具有较高自荧光现象的细胞和组织内钙离子水平以及检测由光感受器和笼锁钙离子螯合剂光激活导致的钙离子释放。

与紫外光激发的荧光探针相比，如Fura-2和Indo-1，可见光激发Ca²⁺探针具有以下特点：1）可被大多数设备的激发器有效激发，包括共聚焦激发扫描显微镜以及流式细胞仪等。2）具有更强的染料吸收性能，使得更低浓度的探针即可成功检测Ca²⁺变化，从而降低了对活细胞的光毒性。3）Ca²⁺依赖性荧光强度增强，对Ca²⁺变化水平检测敏感度更高。4）降低样品自荧光以及光散射的干扰。5）兼容光激活探针以及UV-激发试剂，因此更方便于多参数检测。5）无光谱偏移。

产品性质

运输和保存方法

冰袋运输。-20℃避光干燥保存，有效期6个月。

注意事项

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

需要试剂准备

1） （可选）配制Pluronic F-127母液：100 mg Pluronic F-127粉末（Cat No. 60318ES60）中加入0.5 mL DMSO，配制成20%(w/v)的DMSO母液。溶解过程需要在40-50℃加热20-30 min。溶液室温保存，不要冷藏。如果有结晶析出，可以重新加热后溶解，不影响使用。

2）Hanks?balanced salt solution

使用方法（本实验方案仅供参考，为得到最理想实验结果，需根据具体的实验情况优化实验条件。）

1）Rhod-2/AM储存液的配制

利用高质量无水DMSO溶解Rhod-2/AM配制成2-5 mM的储存液，该储存液可分装于-20℃避光干燥密封保存。每次使用前需回温至室温。

【注】：① 因为Rhod-2/AM在水中的溶解性和稳定性较差，不可用水溶性缓冲液配制Rhod-2/AM储存液。

② 溶解用的DMSO需要保证新鲜无水，否则将会导致AM 体水解，使荧光染料无法进入细胞，影响实验效果。

2）Rhod-2/AM工作液的配制

利用合适缓冲液(如Hanks & Hepes )将Rhod-2/AM稀释成1-10 μM的工作液，具体稀释方法如1 mM母液配制1 mL浓度为4 μM工作液，用1 mL 缓冲液稀释4 μl 1mM母液即可，混匀。

【注】：① 典型工作液浓度为0.1-5μM，对于大多数细胞，我们推荐加载浓度4-5 μM，具体的使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低探针浓度。

② Rhod-2/AM工作液需现配现用，避免反复冻存。

3）（可选）如果Rhod-2/AM进入细胞的效果不好，可向 Rhod-2/AM/DMSO 储存液中加入适量20% Pluronic F127溶液，最终稀释至其终浓度为0.02-0.05%，Pluronic F127 可以防止 Rhod-2/AM在缓冲液中聚合并能帮助其进入细胞。

【注】：Pluronic F127可降低Rhod-2/AM的稳定性，因此只建议在配制工作液时加入，不建议将其加入储存液长期保存。

4）取出预培养的细胞，除去培养基，使用缓冲液洗涤细胞3次。

【注】：如果使用含血清的培养基，血清中的酯酶会分解 AM 体，从而降低Rhod-2/AM进入细胞的效果。另外含有酚红的培养基会使本底值略微偏高，所以加工作液之前需尽量去除培养基残留。

5）将 Rhod-2/AM工作液加入细胞，加入量以覆盖细胞为准。在37℃培养15-60 min，然后除去Rhod-2/AM工作液。

【注】：关于孵育的时间，如果首次做实验不能确定，建议先孵育30 min，看荧光效果：如果细胞死亡较多，适当缩短时间；如果荧光强度太弱，适当延长时间。

6）用不含探针缓冲液洗涤细胞 3 次，以充分去除残留的Rhod-2/AM工作液。然后加入缓冲液覆盖细胞。

7）37℃培养箱孵育约 20-30 min，以确保 AM 体在细胞内的完全去酯化作用。

8）流式细胞仪检测细胞。

【注】：① 某些细胞会将荧光探针被动运输或分泌到胞外，在一些通过阴离子泵泄漏探针的细胞内该现象尤其严重，此时需加入一些抑制剂防止该情况的发生，如加入适量的丙磺舒或磺吡酮。但需注意，抑制剂的加入量必须经过优化，过量的抑制剂也会对细胞造成不利影响。

② 某些细胞具有自体荧光会影响结果分析，需使用未加载探针细胞做对照，在结果分析时在同一波长下扣除自荧光。

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