11684817910罗氏细胞凋亡试剂盒
11684817910罗氏细胞凋亡试剂盒
11684817910罗氏细胞凋亡试剂盒
优点
敏感：细胞凋亡(细胞染色)标签的最大强度高于缺口
快速：使用荧光的dUTP允许后直接TUNEL反应，但在此之前的二次检测系统除了对样品的分析
方便：直接标记程序，使用荧光素-dUTP标记允许在检测过程中的TUNEL反应效率的核查
准确：在分子水平(DNA链断裂)和细胞凋亡的早期阶段的细胞识别凋亡鉴定
灵活：无基板;提供了选择的机会，选择染色过程
产品明细：
一、 原理：
TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素(fluorescein)标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT Enzyme)的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶(HRP，horse-radish peroxidase)的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺(DAB)反应产生很强的颜色反应(呈深棕色)，特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本(石蜡包埋、冰冻和超薄切片)和细胞样本(细胞涂片)在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、 器材与试剂
器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒(塑料饭盒与纱布)、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；
试剂：试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲本、梯度乙醇(100、95、90、80、70%)、DAB工作液(临用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS)、Proteinase K工作液(10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl， pH 7.4-8)或细胞通透液(0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临用前配制)、苏木素或甲基绿、DNase 1(3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5， 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA)等。
三、 实验步骤
操作流程图：制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL反应液→加converter-POD→与底物DAB反应显色→光学显微镜计数并拍照。
具体操作步骤(石蜡包埋切片的检测)：
1. 用二甲本浸洗2次，每次5min；
2. 用梯度乙醇(100、95、90、80、70%)各浸洗1次，每次3min；
注：上面两步是针对石蜡切片样本的处理
4. 用Proteinase K工作液处理组织15-30 min 在21–37°C(温度、时间、浓度均需摸索)或者加细胞通透液8min；
5. PBS漂洗2次；
6. 制备TUNEL反应混合液，处理组用50μl TdT+450μl 荧光素标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100μl DNase 1，反应在15~25℃×10min，后面步骤同处理组。
7. 玻片干后，加50μl TUNEL反应混合液(阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液)于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h。
8. PBS漂洗3次；
9. 可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞(激发光波长为450~500nm，检测波长为515~565nm)；
10. 玻片干后加50μl converter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。
11. PBS漂洗3次；
12. 在组织处加50~100μlDAB底物，反应15~25℃×10min；
13. PBS漂洗3次；
14. 拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲本透明、中性树胶封片。
15. 加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜观察凋亡细胞(共计200~500个细胞)并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断(未染色细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体)
对于.培养细胞的预处理：
①在载玻片上铺一层薄薄的多聚赖氨酸(见备注4)，干燥后在去离子水中漂洗，干燥后4℃保存；
②适当方法诱导细胞凋亡，同时设未经诱导的对照组，各组离心收集约1×106个细胞，PBS洗一次，重悬，加到铺好的多聚赖氨酸载玻片上，自然干燥，使细胞很好的吸附到载玻片上；
③将吸附细胞的载玻片在4%多聚甲醛(见备注2)中固定25min；
④PBS浸洗二次，每次5min；
⑤将吸附细胞的载玻片在0.2%的Triton X-100(见备注5)中处理5min；
⑥PBS浸洗二次，每次5min；
后续操作如同石蜡包埋切片的6—15
四、 注意事项
1. 进行PBS 清洗时，每次清洗5 min。
2. PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS 溶液后再进行下一步反应。
3. 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。
4. TUNEL反应液临用前配制，短时间在冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。
5. 如果20×DAB 溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。
6. 用甲基绿(Methyl Green)染液(3-5%甲基绿溶于0.1M 醋酸巴比妥 PH4.0)染色后，请用灭菌蒸馏水清洗多余的甲基绿。然后进行洗净(100%乙醇)、脱水(二甲本)透明、封片后通过光学显微镜观察操作。如果此时使用80~90%的乙醇洗净时，甲基绿比较容易脱色，注意快速进行脱水操作。
7. 荧光素标记的dUTP液含甲次酸盐和二氯钴等致癌物，可通过吸入、口服等途径进入机体，注意防护。
8. 试剂保存；未打开的试剂盒贮存在-20℃(-15~25℃)；converter -POD液一旦解冻，以后就保存在4℃(2~8℃)下，至少在6 m内稳定，避免再次冻存；TUNEL反应液临用前配好后，放至冰上直至使用。
9. 结果分析时注意：在坏死的晚期阶段或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量DNA断，从而引起假阳性结果；而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA断裂或DNA裂解不完全，以及细胞外的矩阵成分阻止TdT进入胞内反应，进而产生假阴性结果。