Hieff NGS? DNA Library Quantification Kit for Illumina?
产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 储存 | 价格（元） |
Hieff NGS? Library Quantification Kit for Illumina?, qPCR Master Mix | 12302ES05 | 500 T | -20℃ | 1526.00 |
Hieff NGS? Library Quantification Kit for Illumina?, DNA Standard 1-6 | 12307ES09 | 6×96 μL | -20℃ | 2126.00 |
产品描述
本产品是用于lllumina?平台高通量测序文库浓度绝对定量的专用试剂盒，提供定量所需的DNA标准品、qPCR Master Mix、定量扩增引物和参比染料ROX。其中，DNA标准品包含经梯度稀释的六份450 bp的双链DNA片段溶液，浓度为20 pM-0.0002 pM；扩增引物对根据NGS文库接头序列P5和P7设计，可保证特异性扩增双端接头完整的文库分子；qPCR Master Mix是基于抗体法热启动的染料法qPCR预混液，可在不同长度、不同GC或AT含量样本中高效、特异扩增，实现精确定量。
本试剂盒已经过严格的质量和功能检测，试剂盒所有组分均达到DNA污染控制的严格质控要求，应用于NGS文库定量精确灵敏，且批间稳定，结果重现性优异。
产品组分
组分编号 | 组分名称 | 规格 | 12302ES05 | 12307ES09 |
12302-A | Hieff NGS? SYBR qPCR Master Mix (2×) | 5×1 mL | √ | -- |
12302-B | qPCR Primer Mix | 600 μL | √ | -- |
12302-C | 50×Low Rox | 200 μL | √ | -- |
12302-D | 50×High Rox | 200 μL | √ | -- |
- | DNA Standards 1-6 | 6×96 μL | -- | √ |
注意：
1. 根据仪器类型选择合适的参比染料ROX。
类别 | 机型 |
不添加ROX | Bio-Rad CFX96?, CFX384?, iCycler iQ?, iQ?5, MyiQ?, MiniOpticon?, Opticon?, Opticon 2, Chromo4?; Cepheid SmartCycler?; Eppendorf Mastercycler?ep realplex, realplex 2 s; Illumina Eco qPCR; Qiagen/Corbett Rotor-Gene?Q, Rotor-Gene?3000, Rotor-Gene?6000; Roche Applied Science LightCyclerTM480; Thermo Scientific PikoReal Cycler. |
添加50×High Rox | Applied Biosystems 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900HT Fast; StepOne?, StepOnePlus?. |
添加50×Low Rox | Applied Biosystems 7500, 7500 Fast, ViiA?7; Stratagene MX4000?, MX3005P?, MX3000P? |
2. qPCR Primer Mix 中包含一对引物，序列如下，可预先通过引物序列确认文库是否可以被该引物对扩增。
Primer 1：5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA-3'
Primer 2：5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA-3'
运输与保存方法
冰袋运输。所有组分应-20℃保存，qPCR Master Mix与ROX避光保存，有效期6个月；如短期内反复使用，qPCR Master Mix可解冻后于4℃避光暂存，有效期3个月。
注意事项
一、关于操作
1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2. 请于使用前确保产品冻融和彻底混匀，短暂离心收集至管底后置于冰上备用。
3. 为保证产品品质，避免反复冻融超过30次！
4. 为避免样品交叉和气溶胶污染，推荐使用带滤芯的枪头，吸取不同样品时请更换枪头。
5. 试剂吸取时应保证枪头适当深入液体，排出时应确认枪头无残留。
二、关于文库稀释
文库需稀释至标准曲线有效Ct范围内进行定量，稀释比例可参照过往经验或使用其他测定方式测定的浓度作为参考（如NanoDrop?，Qubit?或Bioanalyzer）。使用本试剂盒可定量的文库浓度范围参见下表。
由于DNA在非缓冲环境中易降解，因此应使用缓冲稀释液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0 [25℃] + 0.05% Tween 20）稀释文库，切勿使用水作为稀释液。测定时，文库应现测定现稀释，置于冰上待测，切勿使用以往配制的储存的稀释后文库。
表1 DNA Standard浓度
DNA Standard | 摩尔浓度 | 质量浓度 | 拷贝数浓度 |
Std 1 | 20 pM | 5.5 pg/μL | 12×106 copies/μL |
Std 2 | 2 pM | 0.55 pg/μL | 12×105 copies/μL |
Std 3 | 0.2 pM | 0.055 pg/μL | 12×104 copies/μL |
Std 4 | 0.02 pM | 0.0055 pg/μL | 12×103 copies/μL |
Std 5 | 0.002 pM | 0.00055 pg/μL | 12×102 copies/μL |
Std 6 | 0.0002 pM | 0.000055 pg/μL | 12×101 copies/μL |
三、污染与阴性对照（Contamination and No-template Controls）
1. 进行qPCR实验时，应保证良好的实验操作规范，以防对工作区域、试剂、耗材、仪器、DNA标准品等造成污染。推荐将反应体系配制区和模板制备区进行物理隔离，并定时使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂对各实验区域进行擦拭清理。
2. 反应体系配制过程中DNA Standards的加入应按照从低浓度至高浓度（DNA Standard 6至1）的顺序进行，每次移液都应更换新的枪头，以避免气溶胶污染。
3. 每次实验都应平行进行NTC阴性对照反应，配合融解曲线进行扩增特异性和体系污染程度分析。因扩增引物序列为Illumina?平台固定序列而非qPCR专用引物序列，且扩增循环数较多，NTC阴性对照反应出现引物二聚体扩增进而产生Ct属正常情况。正常情况下Ct (NTC) > Ct (DNA Standard 6) + 3。
四. 扩增曲线基线设置
因DNA Standard 1的摩尔浓度远远高于常规qPCR模板，其Ct往往非常小。而大部分qPCR仪器都默认将3-15循环设置为基线（Baseline），有时会将DNA Standard 1的Ct值误认为是测定时的噪声背景，继而影响标准曲线制作。手动设置基线（Baseline）为1-3循环可以有效避免这种情况发生。
五、文库长度矫正
为避免片段长度对文库绝对定量的影响，需要在定量结果计算时，对文库长度进行矫正。根据文库荧光染料SYBR? Green I结合DNA后产生的荧光强度与DNA分子量成正比的原则，根据以下公式进行文库浓度长度矫正。
矫正后的稀释文库浓度（pM）= [450 bp /文库平均长度（bp）] × 稀释文库的浓度（pM）
六、融解曲线分析
融解曲线在配合NTC阴性对照进行污染程度分析以及确认标准曲线最大有效Ct时至关重要，推荐每次实验都进行融解曲线采集步骤。本产品，DNA Standards产生的熔解曲线呈现特征单峰。
图1 文库标准品熔解曲线
使用方法
一、解冻试剂
将Hieff NGS? qPCR Mix，Primer Mix，DNA Standards 1-6，文库稀释液（10 mM Tris-HCl, pH 8.0 + 0.05% Tween 20），ROX Dye（如需要）从冰箱中拿出，冰浴解冻。各试剂解冻后，涡旋混匀，短暂离心后置于冰上备用。
二、稀释文库
使用文库稀释液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0 [25℃] + 0.05% Tween 20）对待测文库进行适当稀释。推荐稀释度为1:1000-1:100000。对于高浓度文库，可额外设置3个2倍稀释梯度，如按1:1000稀释文库，可额外设置1:2000，1:4000，1:8000稀释比例，以保证测定值在试剂盒所提供的标曲范围内。
三、反应体系配制
于反应管中配制如下，上下颠倒或涡旋振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。
表2 qPCR反应体系
名称 | 体积 |
Hieff NGS? SYBR qPCR Master Mix（2×） | 10 μL |
qPCR Primer Mix | 1 μL |
Diluted DNA Library/DNA Standard 1-6/ddH2O* | 2 μL |
ddH2O | 7 μL |
Total | 20 μL |
注：1）每个反应至少设置3个平行；2）推荐进行20 μL反应体系，如需进行10 μL反应，则将体系各组分等比减少；3）*在阴性对照反应管中加入ddH2O；在样品反应管中加入稀释后的文库；在标准曲线反应管中加入DNA Standards；4）根据机型添加合适ROX，推荐加入量0.4 μL。
四、qPCR运行程序
将反应管置于qPCR仪中，按下述条件设置qPCR反应程序，并运行（熔解曲线可根据仪器默认即可）。
表3 qPCR程序
步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
预变性 | 95℃ | 5 min | 1 cycle |
循环反应 | 95℃ | 10 sec | 40 cycles |
60℃ | 45 sec* |
熔解曲线 | 95℃ | 15 sec | 1 cycle |
60℃ | 60 sec |
95℃ | 15 sec |
注：*当文库平均长度>700 bp时，建议延伸时间延长至90 sec。
五、数据分析
1. 标准曲线制作
1）根据复孔间Ct差异≤0.2的原则，对DNA Standards原始Ct进行过滤，并计算平均Ct。
2）使用有效范围内的Ct（作为纵坐标）和Log[pM]（作为横坐标）绘制标准曲线。参照NTC阴性对照Ct确认标准曲线Ct有效范围。
如Ct (NTC) > Ct (DNA Standard 6) + 3，则最大有效Ct为Ct (DNA Standard 6)，应使用DNA Standard 1-6所产生的Ct绘制标准曲线；
如Ct (DNA Standard 6) + 3 > Ct (NTC) > Ct (DNA Standard 5) + 3，则最大有效Ct为Ct (DNA Standard 5)，应使用DNA Standard 1-5所产生的Ct绘制标准曲线；
如Ct (DNA Standard 5) + 3 > Ct (NTC) > Ct (DNA Standard 4) + 3，则最大有效Ct为Ct (DNA Standard 4)，应使用DNA Standard 1-4所产生的Ct绘制标准曲线；
基于定量准确性考虑，请至少使用4个Ct (DNA Standards)绘制标准曲线。如Ct (DNA Standard 4) + 3 > Ct (NTC)，提示定量体系存在严重污染，需更换体系中所有组分后重复试验。
3）绘制的标准曲线相关系数R2应不低于0.99，斜率应位于-3.1至-3.6之间（表示扩增效率位于90%-110%之间）。如标准曲线参数不佳，应重复试验。
2. 文库浓度计算
稀释文库的Ct只有位于标准曲线有效Ct范围之内才可用于浓度计算，同时应对文库进行长度矫正。可根据下述公式计算原始文库浓度（nM）：
原始文库浓度（nM）= [450 bp /文库平均长度（bp）] × 稀释文库的浓度（pM）× 稀释倍数/1000
六、使用案例
用Hieff NGS? DNA Library Quantification Kit for Illumina?定量嗜盐杆菌基因组DNA文库，文库GC含量为70%，长度450 bp。将文库稀释10000倍上机检测，结果如下图所示。根据标曲及公式，文库终浓度=4.37 pM × 稀释倍数10000=43.7 nM。
图2 文库qPCR精确定量
常见问题
问题 | 可能原因与解决方法 |
扩增效率不在90%-110% | 1. 如Ct (NTC) - Ct (DNA Standard 6) < 3或者Ct (DNA Standard 6) - Ct (DNA Standard 5) < 3.1，且计算扩增效率超过100%，提示反应体系有污染。应根据NTC阴性对照的融解曲线确认污染源（文库污染或DNA Standards污染）。 2. 不恰当的基线基线（Baseline）设置。手动调整基线（Baseline）为1-3循环。 3. 移液精确度差，重复实验，确保所有试剂使用前完全溶解并混匀。 |
相关系数R2 < 0.99 | 1. 移液精确度差，重复实验，确保所有试剂使用前完全溶解并混匀。 2. 仪器相关问题，确保仪器与ROX匹配使用。 |
标曲扩增曲线分布不均一 | 1. Ct (DNA Standard 6) - Ct (DNA Standard 5) < 3.1，提示反应体系有污染。根据NTC 阴性对照的融解曲线确认污染源（文库污染或DNA Standards污染）。 2. Ct (DNA Standard 2) - Ct (DNA Standard 1) < 3.1，提示基线基线（Baseline）设置不当。手动调整基线基线（Baseline）为1-3。 3. DNA Standards之间的ΔCt > 3.6，提示扩增效率差。确认所有试剂在使用前都已充分解冻并彻底混匀；确认所有组分浓度正确以及反应程序无误。 4. 长时间强光照射会导致qPCR Master Mix荧光值下降，进而造成ΔCt > 3.6。应按照推荐方式避光贮存试剂。 |
复孔重复性差 | 1. 移液精确度差，重复实验，确保所有试剂使用前完全溶解并混匀。 2. 仪器相关问题，确保仪器与ROX匹配使用。 |
文库稀释液ΔCt不在合理范围（如2倍稀释文库，ΔCt为0.9-1.1） | 1. 移液精确度差，重复实验，确保所有试剂使用前完全溶解并混匀。 2. 文库难于扩增。GC/AT含量过高或长度超过1 kb的文库扩增效率较差。 3. 文库降解。文库应现用现稀释，稀释好的文库应置于冰上备用。 |
文库各稀释度计算的初始文库浓度差异超过10% | 1. 移液精确度差，重复实验，确保所有试剂使用前完全溶解并混匀。 2. 文库难于扩增。GC/AT含量过高或长度超过1 kb的文库扩增效率较差。 3. 文库降解。文库应现用现稀释，稀释好的文库应置于冰上备用。 |
稀释文库Ct值不在标曲Ct的有效范围 | 1. 使用有效范围内的Ct值计算文库浓度。当Ct (稀释文库) < Ct (DNA Standard 1)，提示文库稀释度不够，应提高文库稀释倍数重复实验。 2. Ct (稀释文库) > Ct (DNA Standard 6)，提示文库稀释度过高，应减少稀释倍数重复实验。 3. 推荐稀释度为1:1000-1:100000。对于高浓度文库，可额外设置3个2倍稀释梯度，如按1:1000稀释文库，可额外设置1:2000，1:4000，1:8000稀释比例，以保证测定值在试剂盒所提供的标曲范围内。 |
DNA Standard 1扩增曲线异常 | 不恰当的基线基线（Baseline）设置。手动调整基线（Baseline）为1-3循环。 |
DNA Standards有扩增，而文库没有或Ct很大 | 1. 文库接头序列错误。核对文库末端序列与试剂盒提供的引物序列是否匹配。 2. 稀释度过高。减少稀释倍数，重复实验。 3. 文库降解。文库应现用现稀释。 |
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