产品名称：Toneclone无缝克隆试剂盒
英文名称：Toneker Fast-Fusion Cloning Kit
产品规格：
产品编号 | 产品规格 | 产品价格 |
TK01143 | 10次/盒 | ￥400 |
TK01145 | 50次/盒 | ￥900 |
产品组成：
1、Fast-Fusion Enzyme
2、10× Fast-Fusion Buffer
产品简介：
Toneclone无缝克隆试剂盒基于DNA序列同源性进行片段重组，可将插入片段PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点。将载体在克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物5’端引入线性化克隆载体末端序列，使得插入片段PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列 (15 bp～21 bp)。这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合后，在Fast-Fusion Enzyme的催化下，最快仅需反应5 min，即可进行转化，完成定向克隆。克隆阳性率可达95%以上。
产品特点：
1、操作简便：无需考虑酶切点限制；
2、快速重组：15min实现载体和片段的快速重组；
3、效率更高：重组效率为传统酶切连接技术的5-10倍，无载体自连现象，阳性克隆可达90%以上。
产品应用：
1、PCR产物克隆进载体
2、基因转移
3、在插入片段前后插入adaptor、linker和标签
4、高通量克隆
A.实验流程概况：
B．制备线性化载体
环形载体需要经过线性化处理，使载体待重组区域暴露出来，以供与插入片段进行重组拼接。线性化的方法可以通过限制性内切酶酶切或PCR方法实现。若采用酶切进行线性化处理，推荐进行琼脂糖凝胶电泳检测，并切胶回收，以尽量避免为切割载体在转化后造成假阳性结果。若PCR扩增得到线性化载体，推荐使用高保真聚合酶进行扩增，减少PCR体系中的模板用量以减少初始质粒造成的假阳性，并在PCR结束后对产物进行切胶回收或使用DpnI酶消化残余质粒模板。
C. 插入片段的PCR引物设计
为了实现同源重组，插入片段扩增产物5’和3’末端需要带有和线性化克隆载体两个末端对应的完全一致的序列（15?21 bp）。下图以pUC19作为克隆载体为例，设计引物：
| Forward Primer → | |
|  15 bp tract (F) BamHI Gene-specific Primer
|
| 5’-CAG GTC GAC TCT AGA GGATCC XXX XXX …-3’ |
Vecor pUC19 Clone site | 5’-TGC CTG CAG GTC GAC TCT AGA G | AATTC ACT GGC CGT CGT TTT ACA ACG-3’ |
3’-ACG GAC GTC CAG CTG AGA TCT CCTAG | G TGA CCG GCA GCA AAA TGT TGC-5’ |
| 3’-… XXX XXX CTTAAG TGA CCG GCA GCA AAA-5’ |
| Gene-specific Primer EcoRI 15 bp tract (R) |
| ← Reverse Primer |
D. 插入片段的PCR扩增
插入片段可选用任何DNA聚合酶进行扩增，Taq DNA聚合酶或其他具有校正活力的高保真酶都可以。若用Taq DNA聚合酶，产物末端的A尾在重组过程中将会被去除，不会因此产生单碱基插入突变。推荐使用高保真酶进行扩增，以减少在插入片段中引入突变。请在PCR完成后，进行琼脂糖凝胶电泳，确认获得单一条带的DNA片段。可切胶回收以除去模板、引物、引物二聚体。可通过与已知的DNA分子量marker比较，确定得到的DNA量。
E．重组反应体系的建立以及反应条件
在冰水浴中，配制如下反应体系，将缓冲、水、线性化载体、插入片段加入PCR管中，轻弹混匀，最后加入酶。
组成成分 | 用量 |
10× Fast-Fusion Buffer | 1 μl |
线性化载体 | 20?100 ng |
插入片段 | 10?100 ng |
ddH2O | 补加至10 μl |
Fast-Fusion Enzyme | 1 μl * |
最适线性化克隆载体与插入片段摩尔比为1:2，可由下列公式粗略计算获得：
? 线性化载体 = [0.01 × 线性化载体长度 (bp)] ng
? 插入片段 = [0.01 × 插入片段长度 (bp)] ng
例如将长度500 bp的插入片段克隆到长度2.7 kb的pUC19中，克隆载体的最适使用量为：0.01×2700=27 ng，插入片段的最适使用量为：0.02×500=10 ng。
注意：1. 当插入片段大于克隆载体时，两者计算用量公式应互换。
2. 线性化载体用量应在20?100 ng之间，插入片段扩增产物用量应在10?100 ng之间。当使用上述公式计算DNA用量超出这个范围是，请直接选择最低/最高使用量即可。例如插入片段200 bp，最适用量计算值为4 ng，实际反应体系中应加入10 ng。
反应体系配制完成后，轻弹混匀，并通过短暂离心使其沉到管底，立即放入已预热的PCR仪或平衡至所需温度的水浴中。按下表中方案选其一进行。推荐在PCR仪中进行反应，60°C，15 min。（若选择在37°C水浴反应，请在10 μl反应中加入2 μl Fast-Fusion Enzyme。）反应结束后应立即将反应管置于冰水浴中冷却10 min，然后直接转化。也可选择?20°C储存，待需要时，冰上解冻并转化。
PCR热循环仪 | 水浴 |
70°C, 5 min | 60°C, 15 min | 37°C, 15 min |
4°C, ∞ | 4°C, ∞ | 冰水浴 |
F．转化
推荐使用转化效率≥108 cfu/μg的感受态细胞，按照对应的说明书操作。若转化效率低于108 cfu/μg，可在凃布前将培养的菌液在6000 rpm离心5 min，沉菌用100 μl培养基重悬后，全部涂于对应抗性的平板上。过夜培养后，形成数百个单克隆，可根据需要选择PCR或酶切鉴定是否为阳性。
G．常见问题与解决方案
问题 | 可能的原因 | 解决方案 |
平板上无克隆或克隆数目很少 | 引物序列不正确 | l 确认引物序列含有15 bp与载体插入区域完全一致的同源序列。 |
PCR产物不纯 | l 优化PCR扩增反应以得到单一PCR产物。 l 换一种纯化方法，纯化您的PCR产物。 |
反应体系中DNA浓度太低 | l 在重组反应中，加入推荐的DNA量。 |
不纯的载体或插入片段抑制重组反应 | l 推荐采用胶回收或离心柱法纯化DNA后进行重组反应。 |
转化过程中加入重组反应液过多 | l 重组反应液的转化体积不应超过转化细胞体积的1/10。 |
感受态细胞转化效率低 | l 更换新鲜、高效的感受态细胞。 |
培养基中加入错误或过多抗生素 | l 在转化平板中加入正确、适量的抗生素。 |
假阳性克隆数目多 | 克隆载体线性化不完全 | l 重新酶切您的载体，增加酶切时间，并胶回收纯化。 |
PCR使用的模板质粒抗性与所需克隆载体抗性相同造成的污染 | l 可在PCR反应之前先将模板质粒线性化。 l PCR产物用DpnI处理，消化模板质粒，然后再纯化。 |
转化用平板放置时间过长导致抗性失效 | l 确认平板新鲜配置，并含有正确、适量的抗生素。 |
克隆含有不正确的插入片段 | PCR产物混有非特异性片段 | l 优化PCR扩增体系，提高特异性或胶回收纯化目的片段。 |
10次/盒 无缝克隆试剂盒厂家直销,使用说明书|同科生物
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