HieffTMqPCR TaqMan Probe Master Mix
产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 储存 | 价格（元） |
HieffTM qPCR TaqMan Probe Master Mix | 11205ES03 | 1 ml (40rxn(25μl/rxn)) | -20℃避光 | 225.00 |
HieffTM qPCR TaqMan Probe Master Mix | 11205ES08 | 5ml (200rxn(25μl/rxn)) | -20℃避光 | 740.00 |
产品描述
HieffTMqPCR TaqMan Probe Master Mix是2×浓缩的qPCR预混合溶液，专为高特异性、高灵敏度实时定量PCR而设计。Mix中含有热启动的HieffTM Hot Start DNAPolymerase，配合针对qPCR优化的最适Buffer，可以有效抑制非特异性的PCR扩增，从而显著提高PCR反应的扩增效率，使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。使用时仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行实时荧光定量PCR，大大简化操作过程，缩短操作时间，降低污染。
本产品针对不同厂商的实时荧光定量PCR仪，分别提供不同浓度的Rox参比液（HighRox/Low Rox），用于矫正孔与孔之间的荧光信号误差。
产品组分
组分编号 | 组分名称 | 产品编号/规格 |
11205ES03（1 ml） | 11205ES08（5×1 ml） |
11205-A | HieffTM qPCR Probe Master Mixa | 1 ml | 1 ml×5 |
11205-B | High ROXb | 40 μl | 200 μl |
11205-C | Low ROXb | 40 μl | 200 μl |
a: 包含HieffTM Hot Start DNAPolymerase，dNTP Mix，Mg2+；
b: 用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。
High ROX适用于以下仪器：ABI 7900HT/7300 Real-Time PCR System和StepOne PlusTM；
Low ROX适用于以下仪器：ABI 7500，7500 Fast Real-Time PCR System，Stratagene Mx3000P；
Roche, Bio-Rad的Real Time PCR仪不必使用ROX。
运输与保存方法
冰袋运输。
本产品应置于-20℃避光储存；尽量避免反复冻融，如每次使用量较少，推荐小份分装使用，有效期半年。
操作流程
【注1】：对模板进行稀释时，请每个浓度梯度至少设置3个重复反应(定量结果分析要求至少三个重复才具有统计意义)
【注2】：由于本品检测灵敏度极高，因此即使空气中微量的气溶胶都可以引起污染，进而导致实验失败，因此反应体系配制时请于超净工作台内进行，配制过程中请使用干净灭菌枪头、反应管，条件容许的实验室推荐使用专用的取液枪，避免污染。推荐使用带滤芯的枪头。
1. Mix经轻微离心后即可使用。上下颠倒混匀Mix，避免剧烈震荡以免产生过多气泡。
2. qPCR反应体系配制
试剂 | 体积1（50 μl） | 体积2（20 μl） |
HieffTM qPCR Probe Master Mix | 25 μl | 10 μl |
Primer 1（10 μM） | 1 μl | 0.4 μl |
Primer 2（10 μM） | 1 μl | 0.4 μl |
TaqMan Probe(10 μM) | 0.5 μl | 0.2 μl |
High/Low ROX | 1 μl | 0.4 μl |
模板DNA | X μl | X μl |
无菌蒸馏水 | Up to 50 μl | Up to 20 μl |
【注】：反应体系中各成分的量可根据以下原则自行调整：
1) 反应体系中引物浓度一般在0.1-1.0 μM之间，一般引物终浓度为0.2μM扩增效果较好；
2) 探针终浓度在50 nM-250 nM之间；
3) cDNA模板的体积不要超过反应体积的1/10；
4) qPCR灵敏度极高，建立反应体系时加入模板量的准确程度对最终定量结果会有很大的影响。因此如仪器允许，推荐您使用50 μl反应体系，并且将模板稀释后（如稀释至5 μl/样本）加入反应体系中，这样可以有效提高实验的重复性。
3. 设置PCR 反应程序
一般采用两步法程序进行反应，即退火/延伸设置在60℃。也可以用三步法进行PCR扩增反应。
95℃ | 5 mina | 预变性 |
95℃ | 10 sec | 循环反应（40 cycles） |
60℃ | ～30 secb |
【注】：
a: HieffTM HotStart DNA Polymerase需要热激活处理以恢复酶活性，如模板中GC含量较高，可将预变性时间延长至10分钟。
b：延伸时间需要根据定量PCR仪所需要的数据采集最短时间限制自行调整，ABI 7700和7900HT设定为30 sec；使用ABI 7000和7300设定为31 sec；使用ABI 7500设定为34 sec；使用ABI StepOneTM Plus时设定在至少10 sec。
4. 反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线，进行标准曲线制作。也可用琼脂糖凝胶电泳进行确认PCR扩增产物特异与否。
引物设计指南
1）引物长度17 bp-25 bp最好。太短的引物容易导致扩增效率降低，太长的引物会导致引物高级结构出现几率增加；
2）引物的GC含量控制在40%-60%之间，最佳为45%-55%；
3）引物A、G、C、T整体分布尽量要均匀，避免使用GC或者TA含量高的区域，尤其是3’端，必须避开GC含量不均匀的区域；
4）尽量避开T/C或者A/G的连续结构；
5）引物3’端最后5个碱基不能包含超过2个以上的G或者C；
6）正向或者反向引物应尽量接近探针序列，但是不能和探针序列有重合区域。
TaqMan探针设计指南
1）探针序列应尽量接近正向或者反向引物，但不能与之有重合区域；
2）探针长度一般为18-40 bp；
3）应避免连续相同的碱基出现，特别是要避免4个以上连续G的出现；
4）探针5’端应避免使用碱基G；
5）探针的退火温度应为65-67℃；
6）如果序列中包含多态性位点，应使其位于探针序列中间。
探针法qPCR反应有效性确认标准
1）线性关系以及扩增效率确认：
标准曲线相关系数（R2）＞0.98
标准曲线斜率介于 -3～-3.5之间
PCR扩增效率（E）介于0.9～1.2之间
2）重复性确认：重复管之间的STD＜0.2
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