T4多聚核苷酸激酶能够催化磷酸基团在ATP的γ-位和寡核苷酸链 (双链或单链DNA或RNA) 的5′-羟基末端以及3′-单磷酸核苷间进行转移和交换。该酶还具有3′磷酸酶活性，将3′-磷酸基团从寡核苷酸的3′磷酸末端、脱氧3′-单磷酸核苷和脱氧3′-二磷酸核苷上水解掉。