动物源性食品中四环素、沙星类
残留量的快速测定方法
1 范围
本方法规定了动物源性食品中四环素类、沙星类高效液相色谱的快速测定方法。
本方法适用于动物源性食品中四环素类、沙星类高效液相色谱的快速测定。
2.1 原理
试样中的残留物经四环素类、沙星类快速检测前处理试剂盒处理，样液经四环素类专用层析柱净化、浓缩用高效液相色谱检测，外标法定量。
2.2 试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。
2.2.1 乙腈：色谱纯。
2.2.2 甲醇：色谱纯。
2.2.3 乙酸铅：分析纯
2.2.4 三乙胺（分析纯）
2.2.5 磷酸（85%）（分析纯）
2.2.6标准品: 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星纯度大于98 %。
2.2.7 标准贮备溶液:分别称取土霉素、四环素、金霉素、强力霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星各10mg，用甲醇溶解并定溶于100 mL棕色容量瓶中，配制成100 µg/mL的标准贮备液，置于-20℃保存，有效期三个月。
2.2.8 混合标准工作溶液:用流动相稀释标准贮备溶液，配制成土霉素、四环素、金霉素、强力霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星均为10 µg/mL的混合标准溶液。0～4℃避光保存。
2.2.9 四环素、沙星类快速检测前处理试剂盒*。
2.3 仪器和设备
2.3.1 高效液相色谱仪：配紫外-可见光波长检测器。
2.3.2 匀浆机。
2.3.3 固相萃取机
2.3.4 离心机：6000 r/min。
2.3.5 调速多用振荡器。
2.3.6 聚四氟乙烯离心管: 2.5 mL，50 mL，具塞。
2.4 样品制备
2.4.1 提取
准确称取已捣碎的样品5.00 g于50 mL离心管中,先加入四环素、沙星类快速检测前处理试剂盒中的提取剂 (液体10mL)，用调速多用振荡器150 rpm振荡3 min，6000 r/min离心5 min，将上清液转移到另一50 mL离心管中，再向样品中加入10 mL 提取剂，重复提取一遍，合并提取液。
2.4.2 沉淀蛋白
向提取液中加入0.05g的乙酸铅，用调速多用振荡器150 rpm振荡2 min，6000 r/min离心5 min，取出10ml，备用。
2.4.3 净化
将2.4.2中的10mL提取液加入四环素专用层析柱中(层析柱使用前依次用5mL甲醇、5mL提取剂激活)挤干，用5mL蒸馏水洗涤，用0.80mL甲醇洗脱,收集洗脱液,用0.2mL流动相定容至1.0mL，过微孔滤膜，供仪器测定。
2.5 测定
2.5.1 液相色谱条件
a) 色谱柱: C18柱，250 mm×4 mm(i.d.),粒度5µm;
b) 流动相: 0.05 mol/L磷酸/三乙胺缓冲液（pH2.4）+乙腈(80+20,V/V);
c) 流速: 1.0mL/min;
d) 柱温: 室温;
e) 检测波长: 四环素类紫外检测器350 nm。沙星类 紫外检测器310nm；荧光检测器激发波长280nm，发射波长450nm。
f) 进样量：50 uL。
3.5.2 标准工作曲线绘制
移取各移取四环素类、沙星类混和标准液，用流动相稀释成20 ng/mL、50 ng/mL、250 ng/mL、500 ng/mL标准工作溶液。按液相色谱条件（3.5.1）进行测定，以色谱峰的峰面积为纵坐标，与其对应的浓度为横坐标作图，绘制标准工作曲线，标准工作曲线范围：20.0~500 ng/mL。
3.5.3 试样测定
用微量进样器准确吸取试样溶液（3.4），按液相色谱条件（3.5.1）进行测定，记录色谱峰的保留时间和峰面积。
3.6 结果计算
按式（1）分别计算供试样品中的四环素类、沙星类残留量。
2×ci×V
ω= …… (1)
m
ω－水产品中四环素、沙星类残留量，μg/kg；
ci －标准曲线上查出试样溶液中四环素、沙星类标准工作溶液的浓度，（μg/L）；
V－最终定容体积数，mL；
2－换算常数；
m－供试试料样品重量，g。
本方法分别计算四环素类、沙星类结果。
3.7 检测限
本方法土霉素、四环素检测限为10µg/kg；金霉素、强力霉素的检测限为20µg/kg，沙星类为：5µg/kg
3.8 回收率
本方法土霉素、四环素、金霉素、强力霉素回收率为:75%～85%；沙星类回收率为：75%～85%
相关谱图