硝基呋喃类代谢物快速检验方法
—UPLC/MS/MS
1 范围
本方法规定了动物源性食品中四种硝基呋喃类代谢物残留量的高效液相色谱串联质谱快速测定方法。
2 原理
试样中残留的硝基呋喃代谢物用硝基呋喃类代谢物快速检测前处理试剂盒提供的试剂提取、衍生化、净化后用液相色谱串联质谱法进行检测，外标法定量。
3 试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。
3.1.1乙腈：色谱纯。
3.1.2甲醇:色谱纯。
3.1.3 乙酸铵：色谱纯。
3.1.4 甲酸：色谱纯
3.1.5 标准品: 氨基脲（SEM）、3-氨基-2-唑烷基酮（AOZ）、5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮（AMOZ）、1-氨基-乙内酰脲（AHD）：≧99%。
3.1.6 标准贮备溶液:准确称量各SEM 、AOZ 、AMOZ 、AHD 各10 mg，用甲醇分别定容于100 mL容量瓶中，配制成100 µg/mL的标准贮备液。
3.1.7 硝基呋喃类代谢物快速检测前处理试剂盒：(提取剂1 20瓶、提取剂2 20瓶（20mL/瓶）、衍生化试剂2瓶、催化剂2瓶、净化柱20根)
4、仪器和设备
4.1.1 Waters ACQUITY UPLC-Micromass Quattro Premier XE
4.1.2匀浆机。
4.1.3旋转蒸发仪。
4.1.4离心机：4 000 r/min
4.1.5可水浴加热超声波清洗机或恒温摇床。
4.1.6聚四氟乙烯离心管:50 mL，具塞。
4.1.7微孔滤膜:0.45 µm。
5、测定步骤
5.1提取、衍生化、净化
5.1.1提取：准确称取已捣碎的样品5.00 g于50 mL离心管中,先后加入提取剂1及提取剂2(液体20.0 mL) 后，漩涡混合后于40℃振摇或超声30min，于6000 r/min离心5 min；
5.1.2衍生化：取出5.1.1中上清液10mL于50 mL离心管中，加入衍生化试剂0.3mL及催化剂0.3mL后混匀，于40℃振摇或超声60 min，取出冷至室温。
5.1.3净化：将净化柱依次用5mL甲醇、5mL水激活后，加5.1.2中试剂正压或负压以2～3mL/min速度过柱，流净后加10mL蒸馏水洗涤，挤干，弃去流出液，用1mL甲醇以2～3mL/min速度洗脱，接收全部洗脱液，用蒸馏水定容至2mL，过0.25µm滤膜,进样分析。
5.2绘制标准工作曲线
移取SEM 、AOZ 、AMOZ 、AHD混和标准溶液，在10mL提取剂2中添加0.5µg/kg、1µg/kg、2µg/kg、5µg/kg标准工作溶液，按5.1测定步骤处理,样液用高效液相色谱仪-串联质谱仪测定，得出标准工作曲线。
5.3测定
5.3.1液相色谱条件
a) 色谱柱: Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18 (100mm×1.0mm i.d., 1.7μm)
b) 柱温:35℃
c) 样品温度:22℃
d）流动相：A5mmol/l乙酸胺+0.2%甲酸 B:甲醇；
e)流动相梯度：
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Time(min)
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Flow Rate(mL/min)
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%A
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%B
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Curve
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1.00
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0.300
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90.0
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10.0
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8
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3.50
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0.300
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20.0
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80.0
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6
|
|
4.00
|
0.300
|
10.0
|
90.0
|
6
|
|
4.30
|
0.300
|
10.0
|
90.0
|
1
|
|
4.50
|
0.300
|
90.0
|
10.0
|
1
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5.3.2 质谱条件
a）离子化模式：正离子API-ES；
b）干燥气流量：8.0L/min;
c) 喷嘴压力:35Pa;
d)萃取锥孔电压:5.00~5.25V
e) 雾化气温度:400~394℃;
f)雾化气流速: 803(L/Hr)
g)反吹气流速:45 L/Hr
h).离子源温度:120～119℃
i) 毛细管电压:2.0～１.97KV
j)衍生化物SIM参数,正离子模式
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化合物
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驻留时间(min)
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母离子>子离子
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锥孔电压(V)
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碰撞能量
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AMOZ
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0.05
0.05
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324.30>280.20,
324.30>251.20
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21.0
21.0
|
11.0
14.0
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|
SEM
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0.10
0.10
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198.2>138.10
198.2>181.10
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22.0
22.0
|
19.0
12.0
|
|
AHD
|
0.05
0.10
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238.20>167.30
238.20>138.10
|
25.0
25.0
|
17.0
20.0
|
|
AOZ
|
0.05
0.05
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225.20>138.10,
225.20>125.10
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30.0
30.0
|
18.0
19.0
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5.3.3色谱测定
根据样液中SEM 、AOZ 、AMOZ 、AHD的含量情况，选定峰面积相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中SEM 、AOZ 、AMOZ 、AHD的响应值均应在仪器的检测线性范围内。
5.3.4空白实验
除不加试样外，按上述测定步骤进行。
5.4结果计算
用色谱数据处理机或按式（2）分别计算供试样品中的SEM 、AOZ 、AMOZ 、AHD残留量。
nci×V
ω= …… (2)
20m
n—为提取样液上清液体积数；
20—液体提取剂体积数；
ω－样品中SEM 、AOZ 、AMOZ 、AHD残留量，μg/kg；
ci －标准曲线上查出试样溶液中SEM 、AOZ 、AMOZ 、AHD标准工作溶液的浓度，μg/L；
V－最终定容体积数，mL；
m－供试试料样品重量，g。
6 测定低限、回收率
6.1检测限
本方法SEM 、AOZ 、AMOZ 、AHD的检测限均为0.5μg/kg。
6.2回收率
本方法SEM 、AOZ 、AMOZ 、AHD回收率为:85%～105%
附质谱离子图
水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定—高效液相色谱法
1 范围
本标准规定了水产品中呋喃唑酮的代谢物3-氨基-2-唑烷基酮（AOZ）、呋喃它酮的代谢物5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮（AMOZ）、呋喃西林德代谢物氨基脲（SEM）和呋喃妥因德代谢物1-氨基-2-内酰脲（AHD）残留量的的高效液相色谱测定方法。
本标准适用于水产品中呋喃唑酮代谢物、呋喃它酮代谢物、呋喃西林代谢物和呋喃妥因代谢物残留量的测定。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3 原理
试样中残留的硝基呋喃类代谢物用硝基呋喃类代谢物快速检测前处理试剂盒提供的试剂提取，经衍生化试剂衍生、经乙酸乙酯反萃、净化后用紫外检测器进行检测，外标法定量。
4 试剂和材料
本标准所用试剂应无干扰峰。除另有特别说明外，所用试剂均为分析纯；试验用水应符合GB/T 6682一级水的要求。
4.1 乙腈:色谱纯。
4.2 乙腈水溶液：乙腈+水=30+70（v/v）
4.3 甲醇:色谱纯。
4.4 乙酸乙酯：色谱纯
4.5 异丙醇：色谱纯。
4.6 庚烷磺酸钠：HPLC级。
4.7 异辛烷：色谱纯。
4.8 乙酸：色谱纯。
4.9 标准品: 氨基脲（SEM）、3-氨基-2-唑烷基酮（AOZ）、5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮（AMOZ）、1-氨基-乙内酰脲（AHD）：≧99%。。
4.10 标准贮备溶液:准确称量各AMOZ、AHD 、AOZ、SEM各10 mg，用甲醇分别定容于100 mL容量瓶中，配制成100 µg/mL的标准贮备液。
4.11 混合标准工作溶液：使用前，取4.10标准贮备溶液用甲醇稀释成所需浓度。
4.12 硝基呋喃类代谢物快速检测前处理试剂盒：内含提取剂1 20瓶、提取剂2 20瓶（20mL/瓶）、衍生化试剂2瓶、催化剂2瓶、净化柱1（C18-CN复合柱） 20根、净化柱2 20根
5 仪器
5.1 高效液相色谱仪：配紫外-可见检测器。
5.2 电子天平：感量0.0001g。
5.3 离心机：0～11000r/min。
5.4 旋转蒸发仪。
5.5 可水浴加热超声波清洗机或恒温水浴摇床。
5.6 氮吹仪。
5.7 旋涡混合器。
6 液相色谱条件
6.1 色谱柱：ＣＮ柱，250 mm×4.6 mm(i.d.),粒度5µm。
6.2 流动相：乙腈＋异丙醇＋乙酸乙酯＋冰乙酸＋0.05%庚烷磺酸钠=5+10+5+0.1+80（V/V）
6.3 流速：1.0 mL/min。
6.4 柱温：25℃。
6.5 检测波长：280nm。
6.6 进样量：50μL。
7 测定步骤
7.1 样品处理
7.1.1 取样
鱼，去鳞、去皮，沿脊背取肌肉；虾，去头、去壳，取肌肉部分；蟹、甲鱼等取可食部分，样品切成小块后，用打浆机打碎，均质混匀，备用。
7.1.2 提取
准确称取已捣碎的样品10 g（精确到0.01 g），置于50 mL离心管中，先后加入提取剂1及10mL提取剂2，漩涡混合后于40℃摇床振摇或超声30min，于6000 r/min离心10 min；取出上清液，再加入10mL提取剂2，重复提取一遍，合并提取液于50mL离心管中。
7.1.3 衍生化
于7.1.2 离心管中，加入衍生化试剂0.5mL及催化剂0.5mL后混匀，于40℃摇床振摇或超声60min，取出冷至室温。
7.1.4 净化
将专用净化柱1（C18-CN复合柱）依次用5mL甲醇、5mL水激活后，加入7.1.3溶液正压或负压以2～3mL/min速度过柱，流净后加5mL蒸馏水洗涤，挤干，弃去流出液，用5mL乙酸乙酯以2～3mL/min速度洗脱，接收全部洗脱液。将洗脱液全部加入专用净化柱2（用之前用2mL乙酸乙酯激活），接收全部流出液40℃沙浴中氮气吹干或40℃旋转蒸干。残留物用1.0 mL乙腈水溶液（4.2）及2mL异辛烷溶解，振荡混匀，5000r/min离心分离，取下层乙腈水层过微孔滤膜供高效液相仪器测定。
7.2 工作曲线
移取适量AMOZ、AHD 、AOZ、SEM混合标准溶液，在10mL 提取剂2中添加，分别使样品添加浓度为0.5µg/kg、1µg/kg、2µg/kg、5µg/kg、10µg/kg，按7.1测定步骤处理,样液用高效液相色谱仪测定，得出标准工作曲线。
7.3 色谱测定
根据样液中AMOZ、AHD 、AOZ、SEM的含量情况，选定峰面积相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中的AMOZ、AHD 、AOZ、SEM响应值均应在仪器的检测线性范围内。在色谱条件下，AMOZ、AHD 、AOZ、SEM的保留时间约为AMOZ 13.8min、AHD 17.2min 、AOZ 20.7min和SEM 22.0min。
8 计算
样品中的AMOZ、AHD 、AOZ、SEM残留量按公式（1）计算。
ci×V
X= …… (1)
m
X－样品中AMOZ、AHD 、AOZ、SEM残留量，μg/kg；
ci －标准曲线上查出试样溶液中AMOZ、AHD 、AOZ、SEM标准工作溶液的浓度，μg/L；
V－最终定容体积数，mL；
m－供试试料样品重量，g。
结果保留小数点后二位。
9 方法回收率
本方法AMOZ、AHD 、AOZ、SEM回收率为：70%~110%。
10 方法检测限
本方法AMOZ、AHD 、AOZ、SEM的检测限均为1.0μg/kg。
11 精密度
两次平行测定结果相对标准偏差≤15%
12 方法的线性范围
本方法的线性范围：硝基呋喃类代谢物混合标准溶液浓度为5ng/mL～500ng/mL。