采用sililca膜，利用小量制备管从各种组织中纯化得到高完整的 micro RNA 。本试剂盒纯化的 micro RNA 分子完整、纯度高，适用于Northern Blot、real-time RT-PCR和芯片分析等各种分子生物学实验。
产品特性
1. 无苯酚和氯仿等刺激性试剂化
2. 采用独特的技术去除蛋白质、DNA和大分子RNA（包括rRNA、mRNA和tRNA）
3. 有效的富集micro RNA以及其它小于200nt的RNA
4. 蛋白质、DNA在上柱前通过沉淀去除，没有 柱堵塞现象
5. micro RNA终产物中无乙醇残留
6. 三种不同的包装规格
流程图
AxyPrep miRNA小量制备试剂盒
本试剂盒用于从各种动物组织、植物组织和细胞中提取 miRNA。提取的miRNA 分子完整、纯度高，适用于Northern Blot 、Real-Time PCR、miRNA 微列阵芯片、原位杂交、RNase 保护测定等各种分子生物学实验。
一、试剂盒组成、贮存、稳定性
Cat. No. AP-MN-MIRNA-50 AP-MN-MIRNA-250
制备次数 50 preps 250 preps
Spin/vac mini column 50 250
2 ml 离心管 50 250
1.5 ml 离心管 50 250
Buffer R-Ⅰ 25 ml 125 ml
Buffer R-Ⅱ 10 ml 50 ml
Buffer TE（nuclease-free） 6 ml 30 ml
说明书 1 1
Spin/vac mini column：小量制备管。室温密闭贮存。
Buffer R-Ⅰ：细胞裂解液。室温密闭贮存。
Buffer R-Ⅱ：中和液。室温密闭贮存。
Buffer TE（nuclease-free） ：洗脱液。10 mM Tris-Cl，0.1 mM EDTA，pH 7.5。
室温密闭贮存。
二、注意事项
Buffer R-Ⅰ含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。
三、实验准备
1. 所有试剂用DEPC处理过的溶剂配制。请选用RNase-free枪头和离心管，以避免提取过程中RNA被RNase降解。
2. 70%乙醇，-20℃预冷。
四、操作步骤
不同的样品提取miRNA的操作中略有区别，具体步骤分述如下：
【从动物组织中提取miRNA】
1. 取20-40 mg组织，转移至预冷的研钵中，加液氮研磨成粉末。
*请按下面说明使用组织的量：
RNA 丰富的组织 (如肝脏) 不超过30 mg
RNA 含量低的组织 (如肌肉) 不超过100 mg
当使用的组织量小于20 mg 时 R-Ⅰ，R-Ⅱ和异丙醇的使用量都减半
当使用的组织量大于 40 mg 时 R-Ⅰ，R-Ⅱ和异丙醇的使用量按比例增加
2. 加入400 μl Buffer R-Ⅰ，用装有21-25号针头的注射器反复抽吸8-10次，转入1.5 ml离心管（试剂盒内提供）中。
3. 加入150 μl Buffer R-Ⅱ，漩涡振荡15-30 s，12,000×g离心5 min。
* 建议在4℃下离心。
4. 取上清至1.5 ml离心管中，加入180 μl无水乙醇，混和均匀。
5. 将制备管置于2 ml离心管（试剂盒内提供）中，转移步骤4中的混合液到制备管中，12,000×g离心1 min。
* 建议在4℃下离心。
* miRNA在滤液中，注意保存滤液。
6. 弃制备管，在滤液中加入500 μl异丙醇，混和均匀。
7. 12,000×g离心10 min,弃上清。
8. 加入700 μl 70％乙醇（﹣20℃预冷），12,000×g离心5min.
9. 弃上清,室温干燥5-10 min。
10.离心管中加入70 μl Buffer TE（nuclease-free）或RNase-free水洗脱miRNA。
【从植物组织中提取miRNA】
1. 取30-150 mg组织，转移至预冷的研钵中，加液氮研磨成粉末。
* 请按下面说明使用组织的量：
植物叶子 通常用量 10-80 mg
植物纤维组织通常用量 100-150 mg
当植物叶组织量小于30 mg 时 R-Ⅰ，R-Ⅱ和异丙醇的使用量都减半
当植物叶组织量大于 80 mg 时 R-Ⅰ，R-Ⅱ和异丙醇的使用量按比例增加
当植物纤维组织量大于 150 mg 时 R-Ⅰ，R-Ⅱ和异丙醇的使用量按比例增加
2. 加入400 μl Buffer R-Ⅰ，用装有21-25号针头的注射器反复抽吸8-10次，转入1.5 ml离心管（试剂盒内提供）中。
3. 加入150 μl Buffer R-Ⅱ，漩涡振荡15-30 s，12,000×g离心5 min。
* 建议在4℃下离心。
4. 取上清至1.5 ml离心管中，加入180 μl无水乙醇，混和均匀。
5. 将制备管置于2 ml离心管（试剂盒内提供）中，转移步骤4中的混合液到制备管中，12,000×g离心1 min。
* 建议在4℃下离心。
* miRNA在滤液中，注意保存滤液。
6. 弃制备管，在滤液中加入500 μl异丙醇，混和均匀。
7. 12,000×g离心10 min,弃上清。
8. 加入700 μl 70％乙醇（﹣20℃预冷），12,000×g离心5min.
9. 弃上清,室温干燥5 -10 min。
10.离心管中加入70 μl Buffer TE（nuclease-free）或RNase-free水洗脱MiRNA。
【从细胞中提取miRNA】
步骤1-3根据细胞培养的方式不同可以选择a或b两种实验方法
a. 悬浮培养的动物细胞或从培养皿、培养瓶中获得的细胞悬浮液或新鲜分离的动物组织单细胞悬浮液：
1a. 收集2×106-1×107的细胞，2,000×g离心5 min，弃上清。
2a. 加入400 μl Buffer R-Ⅰ，用装有21-25号针头的注射器反复抽吸8-10次，转入1.5 ml离心管（试
剂盒内提供）中。
3a. 加入150 μl Buffer R-Ⅱ，漩涡振荡15-30 s，12,000×g离心5 min。
* 建议在4℃下离心。
b. 96-孔, 24-孔,12-孔,或6-孔培养板上贴壁培养的细胞：
1b. 从96-孔，24-孔，12-孔或6-孔培养板里收集细胞，尽量弃去培养基，每孔加入400 μl Buffer R-I，用移液枪上下吹打8-10次。
2b. 转移上述细胞悬浮液到1.5 ml离心管（试剂盒内提供）中，用装有21-25号针头的注射器反复
抽吸8-10次。
3b. 加入150 μl Buffer R-Ⅱ，漩涡振荡15-30 s，12,000×g离心5 min。
* 建议在4℃下离心。
4. 取上清至1.5 ml离心管中，加入180 μl无水乙醇，混和均匀。
5. 将制备管置于2 ml离心管（试剂盒内提供）中，转移步骤4中的混合液到制备管中，12,000×g离心1 min。
* 建议在4℃下离心。
* miRNA在滤液中，注意保存滤液。
6. 弃制备管，在滤液中加入500 μl异丙醇，混和均匀。
7. 12,000×g离心10 min,弃上清。
8. 加入700 μl 70％乙醇（﹣20℃预冷），12,000×g离心5min.
9. 弃上清,室温干燥5 -10 min。
10. 离心管中加入70 μl Buffer TE（nuclease-free）或RNase-free水洗脱miRNA。