反转录PCR（Reverse transcriptase PCR,RT-PCR）是一种从RNA扩增cDNA拷贝的方法。RT-PCR对于获得与克隆mRNA的5’、3’末端序列和从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库方面都是极为灵敏与通用的方法。此外，RT-PCR还易于鉴定已转录序列是否发生突变及呈现多态性，还可用于测定基因表达的强度。我公司采用二步RT-PCR法，可满足客户不同的实验要求。
服务内容：
1. 以总RNA或mRNA为模板逆转录成cDNA。
2. PCR扩增看家基因检测cDNA合成的效率。
3. 目的基因的克隆及测序。
样品要求：
1. 如果提供的材料为总RNA，请提供足量的并且保证纯度的总RNA(浓度500 ng/μl以上，体积20μl以上）。
2. 如果提供的材料为细胞或组织，应保证材料新鲜，动物细胞数为107以上，动物组织为100mg以上。
3. 提供的样品要新鲜并尽可能多，不推荐提供RNA样品，或者提供cDNA，并尽可能详细的提供背景资料（基因序列、Genebank accession number扩增产物的用途等）。
终产品：
实验报告（包括实验方法、照片等）；cDNA；PCR产物。
服务说明：
实验材料必须保证新鲜，请您采样后立即放入液氮中速冻。
基本步骤：
● 模板制备：见RNA提取技术服务。
● 引物合成：客户提供上、下游引物，或者我公司提供免费的引物设计及合成（包括RT-PCR半定量检测中的内参引物）。
● 反转录
（1）Microtube管中配制下列模板RNA/引物混合液，全量<15 μl。
| 试剂名称 |
使用量 |
| 模板RNA |
2μg |
| Oligo(dT)12-18 Primer（50μM） |
2.5μl |
（2）70℃保温5分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上。
（3）离心数秒钟使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Microtube管底部。
（4）在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。
| 试剂名称 |
使用量 |
| 上述模板RNA/引物变性溶液 |
|
| 5×M-MLV Buffer |
5μl |
| dNTP Mixture（各10 mM） |
1.25μl |
| RNase Inhibitor（40 U/μl ） |
25U |
| M-MLV（200 U/μl ） |
200U |
| RNase free dH2O |
up to 25μl |
42℃保温1小时。
（5）70℃保温15分钟后冰上冷却，得到cDNA溶液。
若需要表达，参考基因表达服务。若需要进行RT-PCR半定量分析，接着以下的操作。
● RT-PCR半定量分析
PCR扩增目的基因及看家基因，产物经过琼脂糖凝胶电泳后进行灰度扫描分析。
实验具体收费、标本的收集、实验试剂的定购等事宜，请联系嘉美生物。
实验预约热线：400-698-4168 010-58464308 010-58464306
实验预约邮箱：jiamei_bj@126.com beijing@jiamay.com
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