来自美国宇航局生命技术中心的
世界最先进的旋转式细胞组织培养系统 (3DB)
一．前言
美国NASA公司的专利产品是在微重力环境下，细胞组织的三维高分化度的旋转式培养系统（3DB）（模拟微重力: 以前要在体外模拟正常组织的微环境因细胞外基质太复杂和难适应环境而受阻，而细胞外基质对于调节细胞骨架和细胞核基质蛋白非常重要。3DB使分裂原本应在一起的细胞组织成分的重力问题得到解决）。3DB 也是目前世界上唯一的真正实现微重力的细胞组织培养的系统。3DB是航天和地面科研、临床和生产所需的细胞组织培养系统。
以下是有关3DB影片的旁白：
“美国宇航局(NASA)约翰逊航天中心(JSC)的生物技术计划目前涉及到被重力所限制的或者能在微重力中被改良的生物技术的研究领域，包括细胞培养、细胞分离、细胞融合和生物聚合。
多亏美国的载人航天计划，科学家能较长时间地进入空间这个的独特的研究环境。但是现在，在JSC生物技术实验室的科学家已经发明了一系列出色的能在地球上模拟微重力的部分特征的细胞培养系统。
作为细胞科学家，也许你知道重力对您的研究所带来的影响。重力使我们在试管内培养细胞达不到如同在体内一样的效果。由于气体扩散，营养物的有效性和代谢废物的排除都是有限的，故在平的培养板上的细胞通常仅局限于进行2维生长。在这种受限的环境中，细胞即使能聚集成团，这个团状物通常过小，以至于不适合用来进行较理想的研究。
克服这些重力所致的限制的尝试使得各种包括搅动培养物的系统和那些细胞流动着的培养液从细胞间穿过的系统。即使这些系统已能进行高密度的生长，3维组织生长受限的问题依然存在。
例如在一些传统的生物反应器中，细胞被推进到容器的上部，从而暂时地战胜了重力。但是，重力的这个恒定的向下拉力最终得胜，使细胞沉到容器的更动荡的区域。在这个有湍流和流体动态的剪刀力的区域中，原来在容器较稳定区域所形成的细胞聚集体被分裂。另外，与生物反应器的碰撞同样也会使细胞遭受某种程度的损伤。
任何克服重力所致的限制的暂时的胜利都必须权衡是否损伤细胞和分裂细胞聚合体。但是，在微重力为基础的研究环境中，这种情况并不存在。
在微重力环境中，无沉降和密度不均所致的对流现象。原先在重力环境下，不同的密度的粒子因重力作用而沉降，但在微重力中，他们却能维持在悬浮状态。因为许多这些重力所致的对于培养的限制因素能在微重力中被克服。
在JSC被发明和生产的旋转式的组织培养容器能通过沿水平轴向旋转培养液、细胞和容器壁来模拟微重力的某些特征。
结果是这个低流动剪切的培养环境促进了细胞与细胞间的相互作用，并且增加了细胞的自由度以形成如细胞团状的三维组织。
这种容器也促进了气体和培养液的最理想的扩散，以及废物的最佳排放以得到高密度的细胞和组织培养的产物。
另外一个好处是其具不同的沉降率的细胞能进行共同培养和相互作用，以至形成如在这个共同培养实验中所见的3维聚集物。
在NASA的旋转式细胞培养容器中，象这样的3维聚集物是正常的。故这种特性的3维聚集物经常与细胞的因子的产生和细胞的分化联系起来。
NASA目前有4种特有的培养系统：
1. 慢速转动的单端固定的容器或STL是一种批量培养的容器
2. 原先在设计上用来进行灌注培养和贴壁细胞培养的灌注培养系统
3. 原先在设计上用来进行贴壁和悬浮培养的高截面纵横比或HAR容器
4. 通过复杂的过程控制式计算机来控制组织培养系统的空间生物反应器。
空间反应器能对活体细胞培养条件的参数进行实时控制，如温度、pH平衡、营养物、废液以及对低剪刀力细胞悬浮体进行实时控制。空间生物反应器是在设计上用于微重力的独特的研究工具。当航天飞机回到在地球上后，生物反应器因能模拟部分微重力的特征，从而使得在空间微重力环境中形成的脆的3维的细胞聚集物得以保护。
空间生物反应器在宇宙站与航天飞机和生物技术设施有很好的兼容性。
所有这些容器都是建筑在通过沿水平轴旋转来减少重力因素的基础上的。
美国宇航局(NASA)的旋转式组织培养容器是具划时代意义的在地面上从事的研究的装置，她把微重力的优势带到地面实验室中来。
但是，这些优势并不仅局限于实验室范围内，通过模拟在太空中的微重力环境，这些培养系统是从事以下研究的独特的工具：
1. 低剪刀力
2. 不同大小颗粒的共同培养
3. 有助于3维组织的形成
4. 有助于细胞的分化
凭借其生长和维持聚集物那样的活组织的能力，细胞和组织科学家有条件对新生和外植细胞的生长和相互作用的基本过程进行研究。
在微重力环境下所进行的长期的细胞培养，使得我们能对生物过程进行更深
层次的研究，并且，也为医学和产业的应用打开了大门。”
l【重大意义】
u组织移植：例如3DB培养的肝和自然的在整体上无区别，使局部组织移植成为可能。u疫苗生产：以前丙肝疫苗效果不佳的原因之一是用来产生这种疫苗的病毒并不长在人的肝脏中，现在3DB培养的肝使产生肝炎疫苗的病毒生长在人的肝脏成为现实。3DB在美国已广泛用于生产。u软骨再生：经培养的软骨密度极高，可治疗关节损伤。u激素、酶和其它由人体组织产生的蛋白以及基因工程：经培养的高分化的人体组织，其被刺激后能分泌治疗用的蛋白。例如经培养的神经组织产生的神经生长激素能修复脊椎的损伤。u骨髓再生：培养的骨髓生长情况极佳，且可连续进行增生和低温冷冻保藏，可建大型骨髓库。u糖尿病：胰岛素培养后能插入体内继续生长，无数患者有望免去长期注射胰岛素。u有效杀灭肿瘤：对肿瘤组织活体取样，与自身的白细胞或淋巴细胞在3DB中混合培养，刺激或驯化它们来识别和攻击肿瘤组织，然后把经驯化后有杀伤力的细胞直接注入病灶。这样，这些经感化的淋巴细胞彻底杀灭了肿瘤。u肿瘤、爱滋病、肾病和心脏病的理想模型：培养人的器官、腺体和淋巴结。然后感染这些类器官，再跟踪其生长。把药物用在被感染的经培养的组织模型上，研究其对抗疾病的效果及其对抗方式。例如肿瘤组织的培养有利于测试化疗药在病人自身的经培养和分化的肿瘤上的疗效，避免了用药的盲目性。以前这是在鼠的组织模型上进行的，但物种差异使许多肿瘤在鼠中的生长情况并不好。而在3DB中，所有的肿瘤组织都完好生长，且避免了原先鼠蛋白的干扰。u皮肤移植：经培养的皮肤具有极高分化度避免了以前培养的皮肤在肌理、灵巧度和肤色的不足。
【超前优势】
3DB具有普通培养装置无可比拟的三大特点：
1. 高密度和高分化度：3DB使高分化的人体组织能在体外生长，模仿感兴趣的器官和肿瘤。
2. 模拟微重力: 以前要在体外模拟正常组织的微环境因细胞外基质复杂性和可塑性而受阻，而细胞外基质对于调节细胞骨架和细胞核基质蛋白非常重要。重力是问题之一，它会分裂原本应在一起的细胞组织成分。而3DB使重力问题得到解决。
3. 三维培养: 而普通生物反应器因要保持细胞的悬浮而产生剪切力。其破坏了细胞间和细胞与基质间的稳定，使组织和细胞集中于自身的修复, 而大大影响其生长和其它的正常生理功能的发挥。发孝罐主要培养大量细菌, 不适于大量培养人及其它哺乳动物细胞组织，因很难把大量的细胞移植到发孝罐中, 即使能够培养, 所得的细胞数也有限且很难生成组织。而3DB行且可用于大规模生产，其细胞的成活率平均为97%且分化度极高。
【系统特点】
3DB圆柱状的培养容器中充满了用作培养基的生长液以及细胞或组织材料。整个容器由电机驱动沿水平轴旋转。细胞颗粒在水平轴内建立均质的液体悬浮轨道。培养基以及细胞颗粒随容器一起旋转且不与容器壁和它物相撞。由于系统无推进器、空气升液器、气泡或搅拌器，使破坏性应力减到最小。3DB中的细胞通过膜式气体交换器来吸氧和排出CO2。任何气泡都被清除，以防其旋涡对细胞的生长的影响。无破坏应力使生成的三维组织具有与父系相同的结构和功能。其组织的培养密度为1010至1011个细胞/ml；细胞的培养密度为108。至今所有的细胞组织都能培养。
二．内容
A. 55ml 高截面纵横比容器，
High Aspect Ratio Vessel (HAR)
B. 110ml 圆柱型容器，
Cylindrical Cell Culture Vessel (STL)
C. 10ml 高截面纵横比容器
D. 系统的主机单元
E. 系统的控制和电源一体单元
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第一部分：3DB-Batch旋转式细胞组织批量培养系统
声明: 本中文技术资料是试用版仅供参考，烦请多提意见。用户应以英文版下载)为准。
系统安装简图：
容器装在系统的
主机单元上后放在
CO2培养箱内工作
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极扁的电源和通讯线能非常方便地通过培养箱的密封条而不会破坏培养箱的环境
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简介
立体细胞培养系统（以下简称3DB）是目前世界上培养贴壁和悬浮细胞的最新的装置：
1. 它使研究者能对各种细胞进行高密度的培养；
2. 凡用其它方法不能轻易地培养的细胞组织在3DB中都能容易地进行培养；
3. 在3DB中能实现模仿父系组织的结构和功能的已分化的三维物质共同培养；
4. 3DB是一种重复性高、复杂的、三维的体外培养系统，用来仔细研究结构的变化，分离能控制正常组织分化和新生组织变形的生长和调控分子。
发明于Johnson航天中心的Equl，该系统原先是为保护在宇航中所进行的纤细的组织培养而设计的。然而，它的低剪切力、高的物质传递效率和微重力的独特环境，使我们在普通实验室的组织培养箱内也能生长出三维细胞组织。
NASA提供2种基本的3DB容器：
1. 圆柱型容器(CCCV)呈管状，有一个中央气体交换膜芯，它是为培养贴壁细胞所设计。
2. 高截面纵横比容器(HAR)为盘状的培养容器, 其内壁由氧交换膜所组成。它是为培养悬浮细胞所设计。然而，实践证明，它也是一个理想的贴壁细胞的培养容器。
工作原理
3DB是水平旋转的、无气泡的膜扩散式气体交换的培养系统。
1. 培养液、细胞和细胞团粒在容器内旋转，它们不与容器壁或任何其它易致伤的物体相碰。因该系统无推进器、空气升液器、气泡或搅拌器，故几乎没有破坏性的剪切力，使得大细胞团得以形成。
2. 悬浮细胞和微载体珠粒上的贴壁细胞在水平的旋转式细胞培养容器内产生一个均匀的、极低剪切力的液体悬浮轨道。随着细胞的长大，可调节旋转的速度来抵偿沉降速率。
3. 正常的、新生的、单个的以及共同培养的脆的、人的、贴壁和悬浮细胞在体外得以生长。
相比普通系统来说，新的3DB的一个主要的优势是进行能分化或模仿父系组织结构和功能的组织培养。科学家能得到和在人体内一样的培养产物。这些细胞生长后形成与其父系组织类似的三维组织材料。因为破坏性的旋涡和碰撞力在水平的3DB中是极小的，故这些生长是可能的。这个非常低的剪切力的培养环境对于需要通过培养来生长任何脆弱细胞类型是同样重要的。这些细胞类型包括(当然并不局限于)：杂交瘤细胞、淋巴细胞、骨髓、巨噬细胞、T细胞，甚至植物的原生质体和昆虫细胞。
NASA 的3DB使科学家能在普通的组织培养实验室内生成非常复杂的、脆性的组织。科学家如果需要连续监测他们的细胞培养的话，能轻易地在很短的时间内进行采样而并不损伤所进行的培养。加入细胞成分、化疗成分、营养成分、化学成分或试验性的化妆品而导致细胞培养变化的结果可被严密地观测。关于如何收集培养产物则是非常简单的，只要旋开底盖，倒出培养产物或用移液管吸。无须释放剂或使用刮器。
我们可研究细胞从正常生长，通过畸形生长和发育不良演变到肿瘤，这个细胞由正常生长到恶变的全过程。癌症治疗机构由此能进行化疗药物的筛选试验。爱滋和其它病毒的研究者从而可得到源源不断的人的骨髓和其它能感染、研究和希望用来生成疫苗的寄主细胞。
科学家已成功地用这个美国宇航局NASA发明的3DB来培养了近百种不同类型的细胞，包括人的正常的和恶变的细胞以及悬浮和贴壁细胞。例如，人的恶性黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌和恶性骨瘤的细胞株等。
至今所有在3DB中培养的细胞都获得成功。在一个经常做的试验中，正常人的纤维细胞与人的结肠癌细胞共同培养。在不到一个月内，培养出数百种已分化的结肠癌的息肉，其密度为每直径为1cm的园中有一块。共有5个被分化的细胞类型被检测出，其中包括粘蛋白分泌性杯状细胞。在另外的试验中，恶性黑色素瘤和恶性黑色素细胞能连续生长100天以上。
众所周知，大多数人类的肿瘤是很难用其它方法在实验室中生长的，尽管人的癌细胞能被种植到免疫力缺乏的鼠上，但前列腺癌、乳腺癌在鼠上的传递率只有不到10%。然而，前列腺癌和乳腺癌组织在3DB中就得到成功的培养。而且，这种组织培养的产物中不会含有干扰分析的鼠蛋白。
注意事项(请使用前必须牢记):
1. 不要把容器的任何部件放在漂白的、酸性的或碱性的清洗溶液中。 因清洗后容器中塑料和橡胶的部件中可能含有这些溶液中的有毒性化学物质的残留，会毒害细胞的生长。泡在含氯化物的漂白液中肯定会带来严重毒性问题。
2. 铬酸盐等腐蚀性的试剂会损坏金属部件。研磨性的清洁剂或丙酮等强力的有机清洁复合物将使塑料部件受损并使之不能得到保修。
3. 操作说明中所提供的清洗方法对我们来说已足够了。氧交换膜特别易被损坏。清洗容器时应使用中性的实验室清洗剂。软刷使用起来应非常小心。强度大的清洁剂和硬性的刷子会损伤塑料和橡胶部件。
4. 尽量不要多玩弄整个装置，好意的搀和最终会使许多培养产物夭折。
5. 极扁的电源和通讯线能非常方便地通过培养箱的密封条而不会破坏培养箱的环境。控制和电源一体单元能方便地放在培养箱的上面或旁边，但绝对不能放在培养箱内。
6. 该系统不是转瓶培养装置，所以不能按转瓶的方法来操作。容器中的气泡会产生旋涡并且使细胞致死。请按下面将要讲的方法操作。对于3DB来说，合适的消毒技术可能是唯一可沿用的转瓶操作准则。
7. 在用注射器给容器抽真空时请不要用力过猛，否则会使氧交换膜破裂而不得不重新换膜。
8. 请不要过分拧紧螺栓和配件。过分的用力会在塑料部件上留下伤痕。
9. 过分高的高压蒸汽灭菌温度会很快地老化塑料和橡胶部件，并且使加样阀粘住。我们建议最合适的高压蒸汽灭菌温度为105到110℃, 周期为30分钟。这被证明是足够的，如果还担心灭菌不够的话，我们建议您应当重新再进行一遍灭菌，而不能升高温度。
10. 脏的高压蒸汽灭菌装置中的有毒残渣会渗透到氧交换膜、塑料和橡胶部件上，从而使容器带毒。
11. 我们建议在高压蒸汽灭菌的前夜，容器中应注满乙醇并且浸泡整夜。乙醇是极佳的无毒的去污染溶剂，它也会溶解和去除任何残留的增塑剂。在排空后准备进行高压蒸汽灭菌之前，容器须用培养级的水来漂洗。
12. 在高压蒸汽灭菌的过程中，至少一个阀应被置于开启状态，以防止内压的产生。
13. 在高压蒸汽灭菌之前，圆柱型容器的中央螺帽须旋松一圈。HAR的周边螺帽在高压蒸汽灭菌之前也须旋松一圈。
14. 加样和注射端口的接头在高压蒸汽灭菌之前不能被松开。
15. 在高压蒸汽灭菌之后须拧紧这些被松开的螺帽。
16. 过分地拧紧螺帽会在塑料部件上留下伤痕。
17. 容器应作为一个整体进行高压蒸汽灭菌，这样可避免在组装过程中的污染。
18. 在接种前应使用培养液来漂洗容器。
19. 由于培养液的配方随细胞种类和应用面的不同，没有一个绝对现成的配方可供参考。一般来说，在其它细胞培养设备中应用的很好的培养液的配方在3DB中能同样很好地应用。这些培养液能提供一个好的开端来开发特殊的配方以迎合特殊的应用。附录3中的参考资料提供了已成功应用于3DB的好几个培养液配方的信息。
20. 有湿度的组织培养箱可以减少通过硅橡胶氧交换膜的培养液的流失。这对于10ml的HAR特别重要。
21. 有关特定的细胞培养技术请参见所附的参考资料。
22. 注射器只有带旋锁转换接头(见附录2)后才可使用。因震动和回旋力会使无旋锁的注射器掉落，以致注射器接头的开口外露，使培养液的外溢从而导致污染。
23. 气泡会产生旋涡使细胞致死。尽管可能只有小气泡会产生，一旦被发现就应立即用注射器来抽除，我们应当至少每天应检查一次。
24. 为了使细胞在培养容器中得到均匀分布，旋转基座须水平放稳。这对圆柱型细胞培养容器(CCCV)尤其重要。
25. 15到20RPM作为启动速度对于在微载体珠粒上的贴壁细胞来说是较为合适的。为了补偿培养物的沉降速率，转速必须进行调整。可见的细胞团在容器内形成一个流体轨道并且不与容器壁或中间的膜芯相碰。
26. 淋巴细胞等悬浮细胞在10RPM这个极低的转率时能极容易地悬浮。
27. 如一开始用极小的分生组织碎块来进行培养的话，微载体珠粒可能并不需要。
28. 当容器旋转时，细胞会马上贴附在微载体上。不必要也不主张在贴附阶段使正在旋转中的容器停下来。细胞一般在24小时内会完全贴附于微载体。如旋转停下来了，则氧交换会停止，细胞就会死亡。要得到好的有代表性的样本，在取样时容器不能停转。在实践中，我们常常在容器旋转的过程中用注射器来取样。
A.中央螺栓
B.1/4英寸端口
C.旋锁式注射器端口
D.氧交换膜和芯
E.圆柱型容器
F.前底盖
G.后底盖
H.旋转器基座
I.空气过滤器
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圆柱型细胞培养容器
旋转式细胞批量培养系统选用圆柱型容器时的操作步骤
微载体的准备
如用微载体珠粒来进行贴壁培养, 则要根据厂方的说明书来准备微载体。3DB中一个通常的预置方法是： 每1ml培养液中含5mg微载体珠粒。每个微载体珠粒中含10个细胞对于大多数类型的细胞(2.2x10E5个细胞/ml培养液)进行有效的接种是需要的。
当容器旋转时，细胞会马上贴附在微载体上。不必要也不主张在贴附阶段使正在旋转中的容器停下来。细胞一般在24小时内会完全贴附于微载体。每个细胞的种类和来源都有其各自的特征，我们须个别对待(见附录3)。
容器的准备
■ 注：不要把容器的任何部件放在漂白的、酸性的或碱性的清洗溶液中，因容器会吸收这些溶液而带毒，进而破坏细胞的生长。研磨性的清洁剂或丙酮等强力的有机清洁复合物将使塑料部件受损并使之不能得到保修，从而使容器无用。操作说明中所提供的清洗方法对我们来说已足够了。
1. 用Allen扳手拧开容器顶端的中央螺栓(见图中的部件A)。当把顶端的前底盖松开时缓慢地拧转外壁。对于后底盖也按此操作。拿掉每个底盖中的O型垫圈。
2. 把容器的所有部件放置于充满用于清洗组织培养实验器皿的温的中性的洗涤液的4立升的烧杯中，浸泡1小时。
3. 为了去除任何的残留物须用软刷来清洗塑料部件。
4. 用软刷非常非常小心地来清洗氧交换膜。
■ 注：用力的刷洗会损坏膜料。
5. 用超纯水来连续漂洗容器部件达15-20分钟。
6. 用干净的超纯水来浸泡容器部件并过夜。
7. 把容器的部件从水中拿出，然后放置于吸垫上使其干燥。
8. 再重新组装。
9. 用100%的乙醇注满容器，浸泡24小时。
10. 通过1/4英寸端口把乙醇倒出(先把旋锁式注射器的阀打开)。用超净水灌满容器，浸泡24小时。
11. 通过端口或旋锁式注射器的阀把水倒出。
12. 按如下方法消毒。
消毒
1. 高压蒸汽灭菌法
a. 完全组装好容器。
b. 打开阀门，拿掉2个旋锁式盖子和1个1/4英寸端口的盖子。用铝箔封住这3个孔，并把这些不锈钢的盖子放在玻璃的培养皿内。另一种方法是盖子不拿下来，但要旋松一圈半。
c. (用Allen扳手)旋松中央螺栓一圈。
d. 裹好容器和盖子，在105-110℃高压蒸汽灭菌30分钟。我们不能使高压蒸汽灭菌设备处于低速通风状态。
e. 从高压蒸汽灭菌炉中拿出，使其降至室温。
■ 注：
1) 以上的温度和时间是实际操作中所采用的。过分高的高压蒸汽灭菌温度会很快地老化塑料和橡胶部件；
2) 脏的高压蒸汽灭菌装置中的有毒残渣会渗透到氧交换膜、塑料和橡胶部件上，从而使容器带毒而无用。
f. 在无菌的环境中, 打开所裹的容器, 拧紧周围螺栓并套上盖子。
2. 非高压蒸汽灭菌法
a. 完全组装好容器。
b. 用100%的乙醇注满容器，浸泡过夜。
c. 用起消毒作用的磷酸盐的缓冲液彻底漂洗来去除酒精的残迹。
容器的条件化
1. 如果中央螺栓已经松开；在无菌的环境中，用Allen扳手小心地旋紧中央螺栓。
■ 注：千万不要拧得太紧，因为这要在氧交换膜上留下伤痕。
2. 用移液管把您所选的培养液通过1/4英寸端口注满。
3. 用消毒的酒精垫来擦其它的注射器端口，并把无菌的1/4英寸端口的罩子盖上。
4. 关闭注射器端口的阀门。
5. 用您所选的培养液注满20ml的注射器。用消毒的酒精垫来擦洗一个注射器的端口并接上注射器。
6. 用消毒用的酒精垫来擦洗另外一个注射器的端口并接上空的5ml或10ml的无菌的注射器。
7. 小心地倒置容器并且轻弹容器壁以去除端口下的气泡。用空的注射器把气泡抽去。在2个阀门呈开启状态下，缓慢地注入培养液来取代气泡。
8. 当所有的气泡被去除后，关闭注射器阀门并且拿掉小的注射器。用消毒用的酒精垫来擦洗注射器的端口并用盖封住。
9. 把较大的已注入培养液的注射器留在容器上并且把阀门打开因为容器中的培养液在升温到37℃时体积会略微膨胀。
10. 把容器接到旋转基座上后，一起放入到有湿度的CO2培养箱内。
11. 把电源和信号一体的电缆连到旋转基座上，并把这扁型的电缆从培养箱的密封条间穿出。
■ 注：电源必须放在培养箱的外面。
12. 确保旋转基座是平稳的。
13. 把最初速度置于12-14rpm。
14. 旋转容器一整夜，检查是否有漏和消毒是否彻底。
实验开始
1. 把容器置于消毒罩下。去除端口盖，把它们放在消毒的酒精垫上或消毒的培养皿中。
2. 通过1/4英寸端口把培养液吸出。
3. 用去除血清的生长用的培养液注满容器的50%，腾出空间给要加入的细胞和微载体珠粒(如果使用的话)。（为何这时要去除血清？因这时血清的加入会使泡沫产生，并会加大以后去除气泡的难度)
4. 对所用的细胞进行计数或切碎原组织(每5ml培养液中有10个1mm的小块)
5. 在另外一个加有培养液的器皿中加入细胞进行稀释以得到一个所需的最终的浓度(如其他作者所用的2-3x10E5)
6. 加入合适的清洗过的、预制的微载体珠粒(5mg/ml)来稀释细胞。
7. 用10ml的注射器把细胞/微珠/培养液通过1/4英寸端口注入。
8. 加入合适数量的血清并把容器用培养液灌满。
9. 用酒精垫来擦洗端口，盖上封口并旋紧。关上注射器端口的阀门。
10. 在10ml的注射器中加满生长用的培养液。用酒精垫来擦洗注射器的端口并接上注射器。
11. 用酒精垫来擦洗另外一个注射器端口并接上空的3ml或5ml的已消毒的注射器。把2个注射器端口都打开。
12. 小心地倒置容器并且轻弹容器壁来去除端口下的气泡。用空的注射器把气泡抽去。在2个阀门呈开启状态下，缓慢地注入培养液来取代气泡。
13. 拿去小的注射器，用酒精垫来擦洗端口并封上盖子或接上另外一个注射器。
14. 把较大的已注入培养液的注射器留在容器上并且把阀门打开因为容器中的培养液在升温到37℃时体积会略微膨胀。
15. 把容器接到旋转基座上后，一起放入到有湿度的CO2培养箱内, 检查系统是否平稳。
16. 开启电源，对于组织颗粒或在微载体上的贴壁细胞进行培养，则把最初的旋转速度调置于15-20 rpm；如培养悬浮细胞，则用10 rpm)。
■ 注：细胞和细胞团应该随着容器一起旋转，而不应沉淀于容器内，也不会与容器壁或氧交换膜芯相碰。当速度调好后，细胞和细胞团将沿着容器内的轨道旋转。随着细胞团颗粒体积的增加，为了抵御不断增大的贴壁细胞的沉降速率，旋转速度需要相应地增大。
培养液的更换
1. 关闭电源后马上把容器的基座上卸下，把它放入灭菌的环境中(生物罩)。
2. 把容器竖起来放置(阀门在上)，让细胞/微珠团沉于底部。
3. 关闭任何可以打开的阀门。
4. 卸下所附的任何注射器，用灭菌酒精垫来擦洗端口。
5. 卸下1/4英寸端口盖和任何可能所带的旋锁式盖子，然后放于灭菌的酒精垫上。
6. 通过1/4英寸端口把培养液吸出。通常留下1/4至1/2的起维持作用的培养液于容器中。通过注射器端口吸出微滴。
7. 通过旋锁式注射器或灭菌的滴定管来对容器加培养液。培养液须沿容器壁加入(不打扰细胞团的颗粒)。
8. 生长用的培养液用10ml的灭菌注射器加入。用灭菌酒精垫来擦洗端口并把注射器接上。
9. 用灭菌酒精垫来擦洗其它注射器端口并接上一个空的3或5ml的灭菌注射器。
10. 小心地倒置容器并且轻弹容器壁来去除端口下的气泡。用空的注射器把气泡抽去。在2个阀门呈开启状态下，缓慢地注入培养液来取代气泡。
11. 当所有的气泡被去除时，关上所有注射器的阀门，拿下小的注射器。用灭菌酒精垫来擦洗端口并把盖子套上或注射器接上为将来取样用。
12. 把较大的已注入培养液的注射器留在容器上并且把阀门打开因为容器中的培养液温度变化时体积会略微膨胀。
13. 把容器接到旋转基座上后，一起放入到有湿度的CO2培养箱内, 检查系统是否平稳。
14. 开启电源，调好所需的旋转速度。
取样步骤
1. 如果取样注射器不在容器上的话，把系统停下来。移去注射器端口的盖子并把其放于灭菌的酒精垫上。接上无菌的空的1、5、或10ml的注射器接在阀上。2个阀门都应开启。
2. 开启电源使细胞/微珠团能均匀地分布(2分钟)。
3. 装有培养液的10ml的注射器自接种以来一直接在容器上，通过该注射器把培养液注入到容器中。需要很轻微地通过小的样品注射器向后抽去样品。通过这个操作我们得到一个匀质的具代表性的样品，然而，由于取样时容器仍在旋转，故需要我们经多次的实践才能掌握。
4. 当我们得到所要取的样品(通常1-5ml)时, 关闭电源，关闭取样注射器端口上的阀门并取下加样注射器。
5. 接上另外一个取样注射器或用端口帽盖住。
6. 关上电源并按需调节速度。
7. 如果发现气泡，关闭电源并按前面所提供的程序把气泡去除。
高截面纵横比容器
A.周围螺栓
B.1/4英寸端口
C.旋锁式注射器端口
D.前板
E.后板
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旋转式细胞批量培养系统选用高截面纵横比容器时的操作步骤
微载体的准备
如用微载体珠粒来进行贴壁培养, 则要根据厂方的说明书来准备微载体。3DB中一个通常的预置方法是每1ml培养液中含5mg微载体珠粒。每个微载体珠粒中含10个细胞对于大多数类型的细胞
(2.2x10E5个细胞/ml培养液)进行有效的接种是需要的。
当容器旋转时，细胞会马上贴附在微载体上。没必要也不主张在贴附阶段使正在旋转中的容器停下来。细胞一般在24小时内会完全贴附于微载体。每个细胞的种类和来源都有其各自的特征，我们须分别对待(见附录3)
容器的准备
■ 注：不要把容器的任何部件放在漂白的、酸性的或碱性的清洗溶液中，因容器会吸收这些溶液而带毒，进而破坏细胞的生长。研磨性的清洁剂或丙酮等强力的有机清洁复合物将使塑料部件受损并使之不能得到保修，从而使容器无用。操作说明中所提供的清洗方法对我们来说已足够了。
1. 用Allen扳手拧开容器边缘的周围螺栓(见图中的部件A)。当把小心地把两半部分分开，从而拆开了容器。
■ 注：没必要也不主张在把硅橡胶的氧交换膜从后板上取下来或把金属接头和阀门从前板上分开。
2. 把容器的所有部件放置于充满用于清洗组织培养实验器皿的温的中性的洗涤液的4立升的烧杯中，浸泡1小时。
3. 为了去除任何的残留物须用软刷来清洗塑料部件。
4. 用软刷非常非常小心地来清洗氧交换膜。
■ 注：用力的刷洗会损坏膜料。
5. 用超纯水来连续漂洗容器部件达15-20分钟。
6. 用干净的超纯水来浸泡容器部件并过夜。
7. 把容器的部件从水中拿出，然后放置于吸垫上使其干燥。
8. 再重新组装。
9. 用100%的乙醇注满容器，浸泡24小时。
10.通过1/4英寸端口把乙醇倒出(先把旋锁式注射器的阀打开)。用超净水灌满容器，浸泡24小时。
■ 注：10ml的HAR无1/4英寸端口。在这容器中所有的液体传递通过旋锁式注射器的阀。
11.通过端口或旋锁式注射器的阀把水倒出。
12.按如下方法消毒。
消毒
1. 高压蒸汽灭菌法
a. 完全组装好容器。
b. 打开阀门，拿掉2个旋锁式盖子和1个1/4英寸端口的盖子(如果有的话)。用铝箔封住这些孔，并把这些不锈钢的盖子放在玻璃的培养皿内。另一种方法是盖子不拿下来，但要旋松一圈半。
c. (用Allen扳手)旋松周围螺栓一圈。
d. 裹好容器和盖子，在105-110℃高压蒸汽灭菌30分钟。我们不能使高压蒸汽灭菌设备处于低速通风状态。
e. 从高压蒸汽灭菌炉中拿出，使其降至室温。
■ 注：
1) 以上的温度和时间是实际操作中所采用的。过分高的高压蒸汽灭菌温度会很快地老化塑料和橡胶部件。
2) 脏的高压蒸汽灭菌装置中的有毒残渣会渗透到氧交换膜、塑料和橡胶部件上，从而使容器带毒而无用。
f. 在无菌的环境中, 打开所裹的容器, 拧紧周围螺栓并套上盖子。
2.非高压蒸汽灭菌法
a. 完全组装好容器。
b. 用100%的乙醇注满容器，浸泡过夜。
c. 用起消毒作用的磷酸盐的缓冲液彻底漂洗来去除酒精的残迹。
容器的条件化
1. 如果周围螺栓已经松开；在无菌的环境中，用Allen扳手小心地旋紧螺栓。
■ 注：千万不要拧得太紧，因为这要在氧交换膜上留下伤痕。
2. 对于50ml的容器：用10ml的移液管把您所选的培养液通过1/4英寸端口注满。
对于10ml的容器：用10ml的移液管把您所选的培养液通过注射器端口注满。
3. 用消毒的酒精垫来擦其它的注射器端口，并把无菌的1/4英寸端口的罩子(50ml HAR有)盖上。
4. 关闭注射器端口的阀门。
5. 用您所选的生长培养液注满10ml的注射器。用消毒的酒精垫来擦洗一个注射器的端口并接上注射器。
6. 用消毒用的酒精垫来擦洗另外一个注射器的端口并接上空的3ml或5ml的已消毒的注射器。
7. 小心地倒置容器并且轻弹容器壁来去除端口下的气泡。用空的注射器把气泡抽去。在2个阀门呈开启状态下，缓慢地注入培养液来取代气泡。
8. 当所有的气泡被去除后，关闭注射器阀门并且拿掉小的注射器。用消毒用的酒精垫来擦洗注射器的端口并用盖封住。
9. 把较大的已注入培养液的注射器留在容器上并且把阀门打开因为容器中的培养液在升温到37℃时体积会略微膨胀。
10.把容器接到旋转基座上后，一起放入到有湿度的CO2培养箱内。
11.把电源和信号一体的电缆连到旋转基座上，并把这扁型的电缆从培养箱的密封条间穿出。
■ 注：电源必须放在培养箱的外面。
12.确保旋转基座是平稳的。
13.把最初速度调置于15-20rpm。
14.旋转容器一整夜，检查是否有漏和消毒是否彻底。
实验开始
1. 把容器置于消毒罩下。去除端口盖，把它们放在消毒的酒精垫上或消毒的培养板上。
2. 对于50ml的容器：用Pasteur移液管通过1/4英寸端口把容器中的培养液吸出。
对于10ml的容器：用10ml的移液管通过旋锁式端口把容器中的培养液吸出。
3. 用去除血清的生长用的培养液注满容器的50%，腾出空间给要加入的细胞和微载体珠粒(如果使用的话)。（为何这时要去除血清？因这时血清的加入会使泡沫产生，并会加大以后去除气泡的难度)
4. 对所用的细胞进行计数或切碎原组织(每5ml培养液中有10个1mm的小块)
5. 在另外一个有培养液的器皿中加入细胞进行稀释以得到一个所需的最终的浓度(如其他作者所用的2-3x10E5)加入合适的清洗过的、预制的微载体珠粒(5mg/ml)来稀释细胞。
6. 对于50ml的HAR容器：用10ml的注射器把细胞/微珠/培养液通过1/4英寸端口注入。
7. 对于10ml的HAR容器：用10ml的注射器把细胞/微珠/培养液通过旋锁式端口注入。
8. 加入合适数量的血清并把容器用培养液灌满。
9. 用酒精垫来擦洗端口，盖上封口并旋紧。关上注射器端口的阀门。
10.在10ml的注射器中加满生长培养液。用酒精垫来擦洗注射器的端口并接上注射器。
11.用酒精垫来擦洗另外一个注射器端口并接上空的3ml或5ml的已消毒的注射器。把2个注射器端口都打开。
12.小心地倒置容器并且轻弹容器壁来去除端口下的气泡。用空的注射器把气泡抽去。在2个阀门呈开启状态下，缓慢地注入培养液来取代气泡。
13.拿去小的注射器，用酒精垫来擦洗端口并封上盖子或接上另外一个注射器。
14.把较大的已注入培养液的注射器留在容器上并且把阀门打开因为容器中的培养液在升温到37℃时体积会略微膨胀。
15.把容器接到旋转基座上后，一起放入到有湿度的CO2培养箱内, 检查系统是否平稳。
16.开启电源，对于组织颗粒或在微载体上的贴壁细胞进行培养，则把最初的旋转速度调置于15-20 rpm；如培养悬浮细胞，则用10 rpm)。
■ 注：细胞和细胞团应该随着容器一起旋转，而不应沉淀于容器内，也不会与容器壁或氧交换膜芯相碰。当速度调好后，细胞和细胞团将沿着容器内的轨道旋转。如果培养悬浮细胞的话，速度应较低且速度变化应较小。如果培养贴壁细胞的话，随着细胞团颗粒体积的增加，为了抵御不断增大的贴壁细胞的沉降速率，旋转速度需要相应地增大。
培养液的更换
1. 关闭电源后马上把容器的基座上卸下，把它放入灭菌的环境中(生物罩)。
2. 把容器平置使阀门和1/4英寸端口(50ml HAR)在上，让细胞/微珠团沉于底部。
■ 注：组织颗粒和在微载体上的贴壁细胞能很快地沉降，而许多悬浮细胞却很慢。
3. 关闭任何可以打开的阀门。
4. 卸下所附的任何注射器，用灭菌酒精垫来擦洗端口。
5. 接上一个空的20ml的注射器(如是10ml的HAR话，则用10ml的注射器)。
6. 非常小心地用所附的注射器来把培养液从容器中吸出。通常留下1/4至1/2的起维持作用的培养液于容器中。
7. 用适当规格的注满温热培养液的注射器把新鲜的培养液通过旋锁端口注入。(不要搅乱细胞或团状的颗粒)。
8. 生长用的培养液用10ml的灭菌注射器加入(如是10ml的HAR则用3或5ml的注射器)。用灭菌酒精垫来擦洗注射器端口并把注射器接上。
9. 用灭菌酒精垫来擦洗其它注射器端口并接上一个空的5或10ml的灭菌注射器。
10.小心地倒置容器并且轻弹容器壁来去除端口下的气泡。用空的注射器把气泡抽去。在2个阀门呈开启状态下，缓慢地注入培养液来取代气泡。
11.当所有的气泡被去除时，关上所有注射器的阀门，卸下小的注射器。用灭菌酒精垫来擦洗端口并把盖子套上或注射器接上为将来取样用。
12.把较大的已注入培养液的注射器留在容器上并且把阀门打开因为容器中的培养液温度变化时体积会略微膨胀。
13.把容器接到旋转基座上后，一起放入到有湿度的CO2培养箱内, 检查系统是否平稳。
14.开启电源，调好所需的旋转速度。
■ 注：10 ml的HAR的另外一种可选的培养液的更换方法是：注满培养液的10 ml的注射器能接到旋锁端口上为下次培养液更换而进行预热。一个空的10 ml的注射器被接到另外一个端口上。在下一次培养液更换时，已预热的新鲜的注射器中的培养液被非常缓慢地和小心地注射到容器中，并且多余的培养液被注射到另外一个注射器中。如果培养液注入速度太快，则已沉淀到容器底部的细胞培养产物会被搅乱且其一部分会被回流到吸培养液的注射器中。
取样步骤
1. 如果取样注射器不在容器上的话，把系统停下来。移去注射器端口的盖子并把其放于灭菌的酒精垫上。接上无菌的空的1, 5,或10ml的注射器接在阀上。2个阀门都应开启。
2. 开启电源使细胞/微珠团能均匀地分布(2分钟)。
3. 装有培养液的20ml的注射器(如是10ml的HAR则用10的注射器)自接种以来一直接在容器上，通过该注射器把培养液注入到容器中。需要很轻微地通过小的样品注射器向后抽去样品。通过这个操作我们得到一个匀质的具代表性的样品，然而，由于取样时容器仍在旋转，故需要我们经多次的实践才能掌握。
4. 当得到所要取的样品(通常1-5ml)时, 关闭电源，关闭取样注射器端口上的阀门并取下加样注射器。
5. 接上另外一个取样注射器。开启电源，调好所需的旋转速度。
6. 如果发现气泡，关闭电源并按前面所提供的程序把气泡去除。
第二部分：3DB-Perf旋转式细胞组织灌注培养系统(生物反应器)
声明: 本中文技术资料是试用版仅供参考，烦请多提意见。用户应以英文版(可从www.vwrcn.com下载)为准。
I. 简介
该系统(以下简称Perf)由Equl独有的旋转细胞培养容器和外周的环路部件(泵、多歧管、氧交换器和阀)通过可高压蒸汽灭菌的管道连接而成。氧交换是通过与外环相连的硅胶材料的氧交换器所提供。一个普通的蠕动泵用来使流体通过注入和排出系统而得到循环更换。当培养液呈酸性时，只要开启阀门
灌入培养液就可。pH和葡萄糖的溶度可按需通过手动注射NaOH和葡萄糖溶液来调整。由于系统按经过最优化进行设计，故可不用复杂的泵、电动阀、传感器甚至计算机。
在外环中，Perf有一个泵、一个多歧管、一个氧交换器和几个手动阀。通过开启培养液阀和使出口的培养液流入到废液搜集瓶中，培养液容器中的培养液可以灌注到反应器的容器中。正常的操作是用氧交换器来循环培养液。最大的循环速度，对于1x10E7个细胞/ml来说，仅是大约10 cc/min。流体是通过步进电机驱动的蠕动泵来循环的。多歧管用于连接附加的葡萄糖或NaOH溶液的蓄液瓶。
由于有2个独立的旋转单元，故系统设计有2个电机。这些电机有较长的使用寿命。速度的数显精度为0.1rpm。用“回转器的”悬浮原理，悬浮细胞和在微载体珠粒、胶原巨珠、algenate珠粒或PGA骨架上的细胞都被证明在我们的容器中能极好地生长。组织的外植体能很好地在培养液中进行培养或修复。
本系统可用多种滤膜，它们是20至50微米的聚酯滤膜。包括低蛋白吸附的聚碳酸酯滤膜和不锈钢滤膜。
目前在世界各地已有数千台Perf系统。Equl还可根据用户的特殊需要来定制。
II. 组成
Ø 灌注容器和循环部件
1. 系统的尺寸约：36 cm长x 23 cm宽x 31 cm高。
2. 材料：无毒的聚碳酸酯和白色的聚醛。容器壁的加工精度极高且经蒸汽抛光而使透光率极高。轴是镀过钛氮化合物的不锈钢。接头是由经纯化的不锈钢组成。阀是铜的且镀有持有专利的无毒的陶瓷/Teflon材料。整个底座镀有防腐的陶瓷/Teflon材料。
3. 内部的中间的芯核上的过滤器用一个独立的电机来驱动使之轴向旋转。有以下几个滤芯可提供：27微米的聚酯滤膜; 2000目的不锈钢滤芯；和孔径为1.2mm(3/64英寸)的滤芯。
4. 在120℃高压蒸汽灭菌30分钟。该系统在设计时已考虑了足够的抵御高压蒸汽灭菌的能力。
5. 容器包括两个加样的旋锁式端口和一个9.5mm(3/8英寸)进出端口。
6. 旋锁式接头的流体的进出口用旋转耦合器相连。旋转耦合器是高弹性的工业轴封，其由含碳的Teflon组成，能耐232℃。轴是镀过钛氮化合物的不锈钢(极硬)，使得轴封的寿命极长。耦合器的设计寿命极长，如要更换须在无菌的条件下进行。
7. 氧交换器的膜面积为31cm2 (200平方英寸)。为了保证充分的氧交换，从交换面积上来说这个氧交换器是Equl的批量培养系统中同样规格容器的10倍。
8. 蠕动泵用来使培养液得到循环。从容器的输出端经过多歧管和膜式气体交换器，然后回到容器的输入端。
9. 泵的工作速度可以很快以确保培养液能在容器中快速地灌入和抽去，泵也可低速工作以确保在细胞培养阶段培养液能正常循环。
10. 系统在设计上使得容器能方便地灌入和抽去。容器能方便地从驱动基座上拿下来进行维护。
11. 我们提供一套工具和有关备用件。
l 控制和电源一体单元
它的前面板按钮可调容器的旋转速度和控制蠕动泵。速率计能数显出两个电机的转速。连于旋转基座与
控制和电源一体单元的扁型电缆可很轻易地穿过培养箱的密封条。
III. 工作原理
该灌注式反应器通过使整个容器水平旋转来达到使容器中的物体在流体中悬浮的目的。在容器中无气泡。这样使抑制细胞生长的剪切力达到最小。(有几种类型的材料可供选择的)中央过滤器由另外一个独立的电机所驱动。如果运转速度与容器转速不同的话，则滤器会可用来增加剪切力。这个滤器的电机在低速旋转时可清除沉积在滤器上的颗粒。
外周的环路部件由一个多歧管、一个蠕动泵和一个膜式氧交换器。一个流动惯量容积(5或10cc)的注射器与多歧管相连接。流动惯量注射器提供因温度变化所致的流体容积的改变，并且提供了当样品从反应器容器中抽取时所需的一小部分流体体积。
所有的流体都通过蠕动泵来转移。通过开启培养液的阀门和把3向阀转向废液瓶，该泵被用来注入、抽取和灌注系统。通过开启葡萄糖或NaOH阀和把3向阀转向废液瓶，该泵被用来注射葡萄糖溶液或NaOH溶液。通过关闭所有的输入阀和把3向阀转向循环，该泵被用来循环培养液。
多种滤器可用在容器中，如同用装置可放置组织样品或PGA等被作用物一样。较大直径的滤器可被采纳以形成一个Couette氏粘度计的腔来进行流体的剪切研究。叉或针夹可用来得到大的样品。
IV. 操作说明
l 清洗系统
首先，用洗涤剂彻底清洗系统中的所有部件。通过穿过管道、阀、接头和氧交换器，用水来彻底漂洗。最后需用高纯水来漂洗。然后用70 - 90%的EtOH来清洗系统的所有部件。为了一开始使系统达到无菌，所有的部件须在高纯度的水中浸泡过夜，然后用EtOH浸泡至少8小时。
l 泄漏试验
1. 首先，测试氧交换器。把它的管道接头从系统中取下。把它从它的固定管上取下，把它平铺，夹住管的一头，吹入空气直到完全膨胀。把它浸在水下来捡漏。如有气泡泄出，则说明有漏。气泡如“生长”在氧交换器的表面，则不必被修补。用室温型的硫化剂来修补漏洞。
2. 装好系统把气压表接在多歧管端口上进行压力测试。用50ml的注射器把空气注入加样端之一，使系统加压到4 psi。表值应至少稳定2分钟以上，否则说明系统有漏，直到漏洞被发现并修复后，系统才能使用。
系统在使用前必须是无泄漏的，这是非常重要的。
检查有否泄漏的方法如下：
方法一：用水灌满系统，用注射器给系统加压到4 psi。检查有否液体泄漏如有则维护。
方法二：用气体给系统加压，并在水中浸没容器、多歧管和氧交换器。如有气泡产生，则说明有泄漏。
l 灭菌
系统是为高压蒸汽灭菌而设计的。所有的部件(除了电机)都能承受反复的高压蒸汽灭菌，然而反复暴露在高温和蒸汽高压中会使塑料部件过早老化。培养液瓶和废液瓶以及瓶盖、接口、和通气过滤器同样可被清洗。
我们推荐如下的步骤：
把三个电机从基座上卸下，因电机不是为高压蒸汽灭菌而设计的。开启系统的所有的阀门并移去旋锁式盖子。把入口的Swagelok盖子移去。把培养液和废液瓶上的盖子旋松或分别进行高压蒸汽灭菌。用铝箔遮盖开着的端口。把系统包住，在121 ℃下，用高压蒸汽灭菌30分；或在110 ℃下，用高压蒸汽灭菌20分。
千万不要用高压蒸汽消毒电机或蠕动泵!!!
ETO（气体）消毒
环氧乙烷气体消毒相比高压蒸汽消毒所采用的温度较低，从而将延长反应容器的寿命。然而，ETO对细胞培养物能产生毒性，并且在系统进行气体消毒后会有ETO的残留。如您想采用气体消毒请按如下步骤进行：
按上述方法清洗系统。开启所有的端口，并用能渗透气体的材料把系统包住。气体消毒后不必进行“空气浸泡”。在无菌罩下，用带有几滴盐酸的经消毒的高纯度水来灌满系统和培养液瓶。把废液管道与培养液瓶相连，用酸性的水循环至少8小时(过夜)。在酸性溶液中ETO较易溶解并将按此方法完全被清除。
l 给系统加注
在高压蒸汽灭菌后，把系统移到无菌罩下，重新安装蠕动泵。把无菌的5或10 cc的注射器安在多歧管上作流动惯量备用。用生长培养液注满容器。使容器旋转直至有一个阀在上面。打开容器的旋锁阀从而在加注时能把空气排出。开启培养液阀并导通3向阀进入反复循环。培养液加注到系统时应使蠕动泵维持在高速状态。当容器加满时，关闭通气阀并继续加注直至把流动惯量注射器加到一半。
l 细胞培养
1. 把系统放入到CO2培养箱内，温度平衡时间为数小时，最好是过夜。把培养液样品从容器中抽出，检查其灭菌程度。对于微载体培养，用5mg/ml的Cytodex3的微载体并按至少2x10E5个细胞/ml进行接种。
2. 详见本资料的第一部分：3DB旋转式细胞组织批量培养系统
注：
1. 在系统接种5小时后才能开启泵。
2. 典型细胞培养的最大的泵速是小于通常的10 ml/秒(在BHK21细胞密度为1.6x10E7/ml时)。
3. 简单的操作(以培养液消耗为代价)仅是注入新的培养液来恢复pH值。
4. 一个典型的培养液注入准则是每隔4天在24小时内注入125ml的新的培养液。
5. 通过注入NaOH来恢复pH值和注入葡萄糖溶液来更换葡萄糖，可减少培养液的使用。注射用的葡萄糖液的浓度是5克/升(或更多)溶解于PBS或无血清的培养液中。 (过高的葡萄糖浓度会导致过高的渗透性)。注入的NaOH浓度是0.33M。(比0.33M高的浓度会使蛋白质变性)。滤器装在连于多歧管阀门端口的20cc的注射器中，对这些溶液起消毒作用。每用掉1cc的NaOH溶液，应注入3到5cc的葡萄糖溶液。
提醒：每个葡萄糖分子被代谢成2个乳酸分子。葡萄糖代谢的RQ(呼吸指数)值为0.96，故转换几乎是直接的。每个乳酸可被加入一个NaOH来平衡。故每加1摩尔NaOH，则要相应地加1/2摩尔的葡萄糖。选择的NaOH浓度应较高，但不要太高，否则会损害在培养液中循环的蛋白质。葡萄糖的浓度会非常高因它透过氧交换器时会被稀释成较低的渗透性。葡萄糖能溶解于无血清的培养液中而不是PBS来阻止用水来稀释培养液。
作为最佳的系统控制，用血气分析仪来监测pH、已溶解的氧气浓度和已溶解的CO2浓度。注入NaOH来恢复pH。提高泵速来提高pO2。监测葡萄糖和注入葡萄糖溶液来恢复葡萄糖水平。所需的值可被算出。在下班前注入125ml的培养液并来使系统得到平衡。
NASA也可提供一个建立在这些原理上的pH控制的，完全自动的系统。她可控制溶解的氧气浓度和CO2浓度、pH、葡萄糖以及谷氨酸。
附录1：容器的尺寸(其它尺寸可另选)
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园柱型容器(STL)的尺寸 (单位：cm)
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规格
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55 ml
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110 ml
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250 ml
|
500 ml
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内径(ID)
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2.08
|
2.08
|
2.08
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0.5
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外径(OD)
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5.71
|
5.71
|
5.71
|
8.55
|
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长度
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2.54
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5.13
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11.3
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10.16
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高截面纵横比容器(HAR)的尺寸 (单位：cm)
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规格
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10 ml
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50 ml
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外径(OD)
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4.44
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9.9
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厚度
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0.63
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0.63
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附录2：注射器的旋锁式转换接头的安装
选配件：1. 注射器导管(Syringe Cannula)；
2. 旋锁式转换接头(Injection Site): 对同一种注射成分可重复使用多次。
在无菌条件下进行以下操作：
1. 去除旋锁式转换接头一端的蓝色保护套；
2. 把旋锁式转换接头旋在容器的端口上；
3. 去除注射器导管的保护套；
4. 把注射器套入注射器导管；
5. 再把套有注射器的注射器导管插入旋锁式转换接头另一的封有橡胶状材料的端口中；
6. 示意图如下：
附录3：参考资料（如要全文也可向MEDLINE索取， 其网址为：www.ncbi.nlm.nih.gov 即：National Center for Biotechnology Information，National Library of Medicine，National Institutes of Health）
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