pSURE-TSimple载体连接试剂…

pSURE-T Simple 载体连接试剂盒

目录号：1702

v 试剂盒组成、储存、稳定性：

储存：－20℃  保存，载体反复冻融至少10次不影响使用质量。

v 产品介绍：

pSURE-T Simple Vector是一种高效克隆PCR产物 (TA Cloning) 的专用载体。这种载体是由pUC19载体改建而成，和传统T载体ECOR V切开后加T方法不同，pSURE-T Simple 通过改造pUC19，在原pUC19多克隆位点引入 Xcm I酶切后使其原多克隆位点两侧的3’末端直接产生未配对的T碱基，因此有更高的重组效率。同时它消除了pUC19载体上的多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。此时如果使用PCR扩增引物导入的酶切位点进行DNA酶切时，酶切反应将不会受到T载体上其它多克隆酶切位点上的限制酶影响，可以大大提高酶切效率，增加亚克隆成功率。这种载体尽管消除了LacZ基因上的多克隆酶切位点，但不影响b-半乳糖苷酶的正常表达，因此，PCR产物克隆后仍可以利用a-互补性进行蓝白菌落的筛选， 挑选阳性克隆。由于这种载体是以pUC19载体为基础构建而成，所以它们具有同pUC19载体相同的功能。可以用M13通用引物进行测序（不可用T7通用引物测序，因为T7已经消除了）。

本说明书末列出了pSURE-T Simple 载体相关的技术资料，其全序列可参照pUC19（GenBank Accession Number M77789），只是其多克隆位点部分的序列有所不同。

v 操作步骤：

1.          连接反应的准备：

PCR产物是否要进行纯化取决于扩增产物的质量。如果PCR产物非常干净，不经纯化就可直接进行连接反应。但如果是以质粒为模板的PCR产物则必须进行纯化，模板质粒有可能也形成白斑。PCR产物可以通过琼脂糖凝胶电泳分离。本公司生产的DNA产物快速纯化回收试剂盒对70bp以上的DNA片段能很好地进行回收。

Taq、Tth、AmpliTaq、KlenTaq DNA聚合酶扩增的PCR产物，其末端都带有一个突出的3’ -A。Taq酶和Pfu、Pwo、Tli或Deep vent 等具有3®5’外切酶活性的DNA聚合酶混合扩增的产物末端可能带有3’ -A。具有3’ -A末端的PCR产物可以直接用pSURE-T 进行克隆连接。具有3’®5’外切酶活性的DNA聚合酶扩增的PCR产物是平末端，要对这种平末端PCR产物进行克隆，应先进行3’­-端加A工作。

2.          常规连接反应：

1).        在标准的10 ml连接反应体系中，加入1 ml 30ng pSURE-T Simple载体、X ml PCR产物(在通常状况下，没有必要对PCR产物进行精确定量，一般PCR产物与载体的摩尔比优化至2:1~10:1就可以得到良好结果,推荐3:1)、1ml 10´ligation Buffer和0.5-1ml (2.5 -5 Weiss Units)的T4 DNA Ligase，其余用水补足。按以下体系进行:

1ml                                 10´Ligation Buffer (用前充分融解混匀)

1ml                       10 ´ PEG Enhancer

1ml                                 pSURE-T Simple 载体

Xml                                纯化后的PCR产物/或者1ml 1000bp control

Yml                                无菌水

0.5-1ml（5 Weiss Units/ml)   T4 DNA Ligase

Final Volume       10ml  一般最后加入T4 DNA Ligase。

2).        16℃连接过夜（一般可在PCR仪器完成）。

通常推荐16℃连接过夜（10ml体系标准连接酶量为2.5 Weiss Units），可以得到最多的转化子。虽然本系统在16℃连接1小时（10ml体系推荐连接酶量为5 Weiss Units）即可达一般研究的要求。

3).        冰上冷却，然后转化或贮存于-20℃。

3.          快速连接反应：

1).        反应按以下体系进行：

5ml                                 2 ´ Quick Ligation Buffer

1ml                                 pSURE-T Simple 载体

Xml                                纯化后的PCR产物/或者1ml 1000bp control

Yml                                无菌水

1ml（5 Weiss Units/ml)              T4 DNA Ligase

Final Volume       10ml

一般最后加入T4 DNA Ligase。

2).        16℃连接30分钟（一般可在PCR仪器完成）。

2 ´Quick Ligation Buffer已经包含所有优化的快速连接成份，通常推荐16℃连接30分钟（10ml体系标准连接酶量为5 Weiss Units，长片段连接可以延长至2小时）一般可以得到满意结果。此外本系统在室温（22-25℃）连接5-10分钟（10ml体系推荐连接酶量为5 Weiss Units）即可达一般研究的要求。

3).        冰上冷却，然后转化或贮存于-20℃。

4.          转化：

1).        100ml感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻掸几次将细胞均匀悬浮。

2).        加入4－5ml连接液(最多可全部加入，只要体积不超过感受态细胞体积的1/10)，轻轻混匀。冰上放置30分钟。

3).        42℃水浴热激90秒。冰上放置2~3分钟。

4).        加500ml LB或者SOC培养基(不含抗生素)，37℃ 150 rpm振荡培养60分钟。

5).        将200ml细菌涂布在预先用16ml 50mg/ml IPTG和40ml 20 mg/ml X-gal 涂布的氨苄青霉素平板上。

涂布细菌的用量依连接的效率及感受态细胞的感受率而进行适当的调整，涂布剩余的菌液可以搁在4度保存，第2天如果转化菌落数量少，可将剩余菌液全部涂一个新培养板。

6).      平板在37℃下正向放置1小时以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜。

5分钟室温快速转化

1).        100ml感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻掸几次将细胞均匀悬浮。

2).        加入4－5ml连接液(最多可全部加入，只要体积不超过感受态细胞体积的1/10)，轻轻混匀。室温放置5分钟。

3).        加500ml LB或者SOC培养基(不含抗生素)，37℃ 150 rpm振荡培养60分钟。

4).        按照正常转化步骤继续进行。

5.          筛选：

1).        转化子的蓝白筛选：

当外源DNA片段插入到pSURE-T Simple 中后，由于外源DNA的核酸序列存在改变了LacZ基因的编码，从而影响了其产物b-半乳糖苷酶a-片段的活性，因此重组克隆在X-gal/IPTG平板上呈现为白色，而非重组克隆呈蓝色。有的时候插入片段没有影响lacZ 基因读码框， 或插入片段太小，这种情况下菌落（重组克隆）呈现淡蓝色或者在菌落中心呈现淡蓝斑点，外圈白色（鱼眼状蓝斑fish eye）。选择在IPTG/X-gal平板上生长的白色菌落或者淡蓝色菌落，用牙签挑至含氨苄青霉素的液体培养基，37℃培养过夜。

2).        转化子的鉴定：

a.   选用合适的酶切位点（比如插入片段引入的酶切位点）酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳检查片段大小，确定是否含有目的片段。

b.   挑取白色菌落直接进行PCR检测（可参见分子克隆第3版本或者咨询我们）

c.   用M13通用引物或其它合适的引物测序来确定是否含有目的克隆。