流式细胞仪操作规程

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流式细胞仪操作规程
发布时间 2007/6/4 点击 5052 次

流式细胞仪操作规程目录

1：淋巴细胞亚群测定

2：HLA-B27测定

3：CD55／CD59测定

4：血小板抗体测定

5：红细胞抗体测定

6：粒细胞抗体测定

7：白血病免疫分型测定

8：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定

9：XL操作步骤

淋巴细胞亚群测定

(流式细胞仪)

医院检验科

操作规程文件号：

200 年月日起实施

第1版

(共3页)

本规程每2年复审一次

复审日期：年月日

复审人：

规程编写者：

审批者：

批准日期：年月日

文件分发部门和／或个人

院档案室保管者：

检验科主任：

检验科实验室：

淋巴细胞亚群测定

(CD系列)

方法

流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)

原理：

双/三色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数。淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+；B淋巴细胞：CD5+，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8+；NK细胞：CD3-CDl6+56+等。根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数。

标本采集与处理

受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。

采集部位 静脉采血

抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血

要求 1．样本量至少1ml。

2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。

3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×10⁹/L之间。若>10.0×10⁹/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×10⁹/L，应分离单个核细胞。

4．溶血样本不能用。

试剂

品牌剂型规格贮存

贝克曼库尔特

成分 1：单克隆抗体液体 1ML 2—8℃

2：全血溶血试剂液体

A：甲酸液体 70ML 室温

B：碳酸钠等液体 32ML 室温

C：多聚甲醛液体 14ML 室温

3：鞘液液体 20L 室温

4：清洗液液体 5L 室温

5：荧光微球液体 10ML 2-8℃

质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。

仪器

BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra

样本制备：

1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照

2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。

3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟

4)溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血)

b. 使用COULTER Q—PREP制备系统

开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。

（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）

5)上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样）

报告结果

报告百分数（和绝对值）

操作性能

精密度批内五次重复CV<2％

灵敏度 500—1000个荧光素分子

参考值(百分数（绝对值）)

CD3+ 60.8-75.4%(1141-1880) CD4+ 29.4-45.8%(478-1072)

CD8+ 18.2-32.8%(393-742) NK 9.5-23.5% (175-567)

Th/Ts 1.05-2.03

临床意义

1.T、B淋巴细胞亚群是重要的免疫状态检测指标，在肿瘤、免疫缺陷、病毒感染，自身免疫性疾病、创伤、急性感染、多脏器功能衰竭、器官移植等具有临床诊断、病情判断、治疗等价值。

临床常用Th／Ts比值来判断病人的免疫状况。

Th／Ts比值升高：表示免疫功能亢进：见于自身免疫性疾病，如SLE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力以及HBsAg+乙肝等。

Th／Ts比值减低：表示免疫功能下降：艾滋病、病毒感染、肿瘤病人、慢活肝和活动性肝硬化、再生障碍性贫血、粒细胞减少患者。

2：NK细胞主要破坏各种肿瘤细胞和感染某些病毒、细菌的细胞，所以在抗肿瘤和防御疾病中起主要作用。NK活性减低主要见于各种恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、应用免疫抑制剂，疲劳综合征病人等，NK活性随年龄增长而减退。NK细胞也参与第二型超敏反应和移植物抗宿反应，白介素-2治疗后；外周血NK细胞增加。

方案（Protocol）

HLA-B27测定

(流式细胞仪)

医院检验科

操作规程文件号：

200 年月日起实施

第1版

(共3页)

本规程每2年复审一次

复审日期：年月日

复审人：

规程编写者：

审批者：

批准日期：年月日

文件分发部门和／或个人

院档案室保管者：

检验科主任：

检验科实验室：

HLA-B27测定

方法

流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)

原理：

双色直接免疫荧光法。将HLA-B27-FITC/B7-PE单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗体结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，测定HLA-B7阴性而HLA-B27阳性细胞的平均荧光强度和所占的百分比。

标本采集与处理

受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。

采集部位 静脉采血

抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血

要求 1．样本量至少1ml。

2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。

3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×10⁹/L之间。若>10.0×10⁹/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×10⁹/L，应分离单个核细胞。

4．溶血样本不能用。

试剂

品牌剂型规格贮存

贝克曼库尔特

成分 1：单克隆抗体液体 1ML 2—8℃

2：全血溶血试剂液体

A：甲酸液体 70ML 室温

B：碳酸钠等液体 32ML 室温

C：多聚甲醛液体 14ML 室温

3：鞘液液体 20L 室温

4：清洗液液体 5L 室温

5：荧光微球液体 10ML 2-8℃

仪器

BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra

样本制备：

1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照(IgG2a-FITC／IgG1-PE)

2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。

3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟

4)溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血)

b. 使用COULTER Q—PREP制备系统

开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。

（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）

5)洗、离心、上机测样（备注：测B27一定要至少洗一遍方可上机检测）

报告结果

报告阴阳性

操作性能

精密度批内五次重复CV<2％

灵敏度 500—1000个荧光素分子

参考值

阳性：HLA-B27阳性而HLA-B7阴性细胞的平均荧光强度在8.0以上。

临床意义

HLA复合体位于第6号染色体的短臂上，该区DNA片段长度约3000-4000KB，占人体整个基因的1/3000，HLA-B27是HLA-I类基因中B位点上的一个等位基因，与多种疾病具有相关性，尤其是强直性脊柱炎。

方案（Protocol）

CD55/CD59测定

(流式细胞仪)

医院检验科

操作规程文件号：

200 年月日起实施

第1版

(共3页)

本规程每2年复审一次

复审日期：年月日

复审人：

规程编写者：

审批者：

批准日期：年月日

文件分发部门和／或个人

院档案室保管者：

检验科主任：

检验科实验室：

CD55/CD59测定

方法

流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)

原理：

双色直接免疫荧光法。近年的研究表明，红细胞和白细胞膜上CD55和CD59分子的表达量和缺乏表达细胞的数量对PNH诊断和鉴别有重要意义。血细胞(红细胞和白细胞)通过膜上的抗原分子与荧光素标记的CD55或CD59的多克隆抗体结合。用流式细胞仪检测CD55或CD59表达阳性细胞百分数。

标本采集与处理

受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。

采集部位 静脉采血

抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血

要求 1．样本量至少1ml。

2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。

3．溶血样本不能用。

试剂

品牌剂型规格贮存

贝克曼库尔特

成分 1：单克隆抗体液体 1ML 2—8℃

2：全血溶血试剂液体

A：甲酸液体 70ML 室温

B：碳酸钠等液体 32ML 室温

C：多聚甲醛液体 14ML 室温

3：鞘液液体 20L 室温

4：清洗液液体 5L 室温

5：荧光微球液体 10ML 2-8℃

仪器

BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra

样本制备:

(一)白细胞CD55／CD59检测

1．准备2支流式细胞仪专用管，分别标记。分别向二管中加入样品100ul。

2．溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血)

b. 使用COULTER Q—PREP制备系统

开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。

（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）

3．离心后分别加入CD55/CD59 10ul和相应的同型对照10ul。避光20-30分钟。

4．洗涤离心

5．上机测样

(二)红细胞CD55／CD59检测

1．准备2支流式细胞仪专用管，分别标记

2．分别加入CD55／CD59 10ul和相应的同型对照10ul。

3．向二管中加入1：200稀释的样品100ul（可根据红细胞的数量调整），避光20-30分钟。

4．洗涤离心。

5．混匀、上机测样。

报告结果

报告百分数

操作性能

精密度批内五次重复CV<2％

灵敏度 500—1000个荧光素分子

参考值

CD55>97% CD59>97%

PNH的临界值：RBC CD59>95% WBC CD59>90%

PNH的诊断值：RBC CD59>91% 大部分>80%

中性粒细胞CD59>84%

临床意义

用于AA和PNH的诊断和分型诊断。PNH时CD55和CD59明显减低和缺如。

方案（Protocol）

血小板膜表面抗体测定

(流式细胞仪)

医院检验科

操作规程文件号：

200 年月日起实施

第1版

(共2页)

本规程每2年复审一次

复审日期：年月日

复审人：

规程编写者：

审批者：

批准日期：年月日

文件分发部门和／或个人

院档案室保管者：

检验科主任：

检验科实验室：

血小板膜表面抗体测定

方法

流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)

原理：

直接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体，加到经离心富集的血小板中，与血小板膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析。

标本采集与处理

受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。

采集部位 静脉采血

抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血

要求 1．样本量至少1ml。

2．样本应在采集后6小时内完成，冷冻的标本或已固定的标本不能用。

3．样本血小板计数应在150-450×10⁹/L之间。若>450×10⁹/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若<150×10⁹/L，应多采集进行富集达到流式检测的细胞数。

4．溶血样本不能用。

试剂

品牌剂型规格贮存

联科

成分 1：单克隆抗体液体 1ML 2—8℃

2：全血溶血试剂液体

A：甲酸液体 70ML 室温

B：碳酸钠等液体 32ML 室温

C：多聚甲醛液体 14ML 室温

3：鞘液液体 20L 室温

4：清洗液液体 5L 室温

5：荧光微球液体 10ML 2-8℃

仪器

BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra

操作：

富集血小板法：

1）800r/min*15min,取上清，

2）加4－5ml鞘液，2000r/min*3min,弃上清，重复一次。

3)分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC)

4)分别向试管中加入准备好的10u1含血小板的PBS（血小板的量约为10⁶）（血小板若在正常范围，稀释到原量直接取10u1。）。

5)混匀，避光，室温孵育20-30分钟

6)洗或不洗，上机测样

全血法：

1）加4－5ml鞘液，1500r/min*15min,弃上清，后同上3）－6）

报告结果

报告百分数

操作性能

精密度批内五次重复CV<2％

灵敏度 500—1000个荧光素分子

参考值

IgA<2.98% IgG<3.04%

IgM<3.0% IgD<2.91%

临床意义

为免疫性血小板减少性紫癜(ITP)诊断、治疗、预后估计的重要指标，在ITP、胶原性疾病时升高。

方案（Protocol）

红细胞抗体测定

(流式细胞仪)

医院检验科

操作规程文件号：

200 年月日起实施

第1版

(共2页)

本规程每2年复审一次

复审日期：年月日

复审人：

规程编写者：

审批者：

批准日期：年月日

文件分发部门和／或个人

院档案室保管者：

检验科主任：

检验科实验室：

红细胞膜蛋白结构测定

（红细胞抗体）

方法

流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)

原理：

直接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体，加到全血中，与红细胞膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤(和固定)等步骤后，在流式细胞仪上进行分析。

标本采集与处理

受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。

采集部位 静脉采血

抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血

要求 1．样本量至少1ml。

2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。

3．溶血样本不能用。

试剂

品牌剂型规格贮存

联科

成分 1：单克隆抗体液体 1ML 2—8℃

2：全血溶血试剂液体

A：甲酸液体 70ML 室温

B：碳酸钠等液体 32ML 室温

C：多聚甲醛液体 14ML 室温

3：鞘液液体 20L 室温

4：清洗液液体 5L 室温

5：荧光微球液体 10ML 2-8℃

仪器

BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra

操作：

1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC)

2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血（1：200稀释后）。

3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟

4)上机测样

报告结果

报告百分数

操作性能

精密度批内五次重复CV<2％

灵敏度 500—1000个荧光素分子

参考值

IgA<2.78% IgG<2.98%

IgM<2.52% IgD<2.88%

临床意义

自身溶血性贫血的分型诊断

方案（Protocol）

粒细胞抗体测定

(流式细胞仪)

医院检验科

操作规程文件号：

200 年月日起实施

第1版

(共2页)

本规程每2年复审一次

复审日期：年月日

&nb,sp; 复审人：

规程编写者：

审批者：

批准日期：年月日

文件分发部门和／或个人

院档案室保管者：

检验科主任：

检验科实验室：

粒细胞抗体测定

方法

流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)

原理：

直接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体，加到经溶血处理后的样本中，与粒系胞膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析

标本采集与处理

受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。

采集部位 静脉采血

抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血

要求 1．样本量至少1ml。

2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。

3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×10⁹/L之间。若>10.0×10⁹/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×10⁹/L，应分离单个核细胞。

4．溶血样本不能用。

试剂

品牌剂型规格贮存

联科

成分 1：单克隆抗体液体 1ML 2—8℃

2：全血溶血试剂液体

A：甲酸液体 70ML 室温

B：碳酸钠等液体 32ML 室温

C：多聚甲醛液体 14ML 室温

3：鞘液液体 20L 室温

4：清洗液液体 5L 室温

5：荧光微球液体 10ML 2-8℃

仪器

BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra

操作：

1) 溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血)

b. 使用COULTER Q—PREP制备系统

开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。

（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）

2)分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC)

2)分别向试管中加入经溶血处理得样本100u1。

3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟，洗涤离心

4)上机测样

报告结果

报告百分数

操作性能

精密度批内五次重复CV<2％

灵敏度 500—1000个荧光素分子

参考值

IgA<2.68% IgG<2.66%

IgM<2.49% IgD<3.4%

临床意义

白细胞减少症的分型诊断，大多数白细胞减少症患者抗体为阳性

方案（Protocol）

白血病免疫分型测定

(流式细胞仪)

医院检验科

操作规程文件号：

200 年月日起实施

第1版

(共3页)

本规程每2年复审一次

复审日期：年月日

复审人：

规程编写者：

审批者：

批准日期：年月日

文件分发部门和／或个人

院档案室保管者：

检验科主任：

检验科实验室：

白血病免疫分型测定

方法

流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)

原理：

三色直接免疫荧光法。正常血细胞的分化成熟过程中，细胞膜、细胞浆有抗原的表达与血细胞的分化发育阶段密切相关，因此这些抗原的表达与否可作为鉴别细胞和其分化阶段的基础。利用荧光素标记的单克隆抗体对血液或骨髓进行染色，通过FCM对白血病细胞细胞膜和细胞浆抗原进行分析，由此了解所测白血病细胞的系列属性及其分化程度。三色染色在白血病免疫分型中较为常用。根据分型需要，选择相应抗原的标记抗体，一般FITC标记抗体和PE标记抗体搭配为一组，再加PC5标记抗原CD45单克隆抗体，共三种抗体加入一管

标本采集与处理

受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，腰穿采骨髓。

采集部位 腰穿采骨髓

抗凝剂 肝素抗凝

要求 1．样本量至少3ml。

2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本或已固定的标本不能用。

3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×10⁹/L之间。若>10.0×10⁹/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×10⁹/L，应分离单个核细胞。

4．溶血样本不能用。

试剂

品牌剂型规格贮存

贝克曼库尔特

成分 1：单克隆抗体液体 1ML 2—8℃

2：全血溶血试剂液体

A：甲酸液体 70ML 室温

B：碳酸钠等液体 32ML 室温

C：多聚甲醛液体 14ML 室温

3：IntraPrep Permeabilization Reagent

成分1（固定剂）液体 5ml 室温

成分2（透膜剂）液体 5ml 室温

4：鞘液液体 20L 室温

5：清洗液液体 5L 室温

6：荧光微球液体 10ML 2-8℃

仪器

BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra

操作-样本制备：

细胞膜表面抗原

1．首先准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体。

2．首先每管中加入5ul CD45-PC5抗体。

[来源：来宝网]

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