摘 要 一氧化氮(NO)是近年来生物医学界研究的前沿和热点之一。NO合成得过多或不足与许多疾病的发生机制有关。NO含量的检测可能为心血管疾病、败血症休克等的诊断提供依据。吸入NO及使用NO供体、NO生成调节剂等已为一些医学问题的解决提供了帮助,并可能给更多重、危、顽症的治疗带来新的希望和线索。 关键词: 一氧化氮 检测 治疗 1 NO的研究概况
1986年底,纽约州立大学Furchgott和加州大学洛杉矶分校的Ingarro分别独立地提出内皮细胞舒血管因子endothelium-dreived relaxing factor,EDRF)的本质是NO。1987年,英国Wellcome实验室的Palmer等采用化学发光法比较直接地证明了内皮细胞可以释放NO。
进入90年代,有关NO的研究跨入一个迅猛发展的阶段,1992年,美国《Science》杂志将NO评为该年度的“年度分子”(molecule of the year )。NO在多个系统的生理病理过程中所起的重要作用不断被阐明,使NO的研究渗入到众多学科,成为生物医学领域的热点和前沿之一。
已研究表明[1],NO参与血管和气管平滑肌的舒张、中枢和自律神经的传递、细菌的杀伤、肿瘤细胞的融解、内分泌激的释放、机体免疫防御、吸收功能的调节等。NO是机体内重要的信使分子、效应分子和免疫调节分子的观点,已为学术界所广泛接受。1998年,Furchgott,Ignarro和Murasd三人作为“NO能在心血在管系统中充当信号分子”的发现者而荣获该年度诺贝尔生理及医学奖。
2 NO检测在实验诊断中的应用
2.1 NO合成及生物学作用[2] 内源性NO是由NO合酶(nitric oxide synthase ,NOS)催化L-精氨酸(L-Arg)末端胍基中的一个氨原子氧化而生成。
NO的合成受多种因素的影响。NOS是NO合成的关键酶,根据其存在的部位及作用机制的差异,分为固有型(constitutive nOS,cNOS)和诱导型(inducive NOS,iNOS)两类。cNOS驻要存在于内皮细胞(又称内皮型NOS,endothelial nOS,eNOS)及神经细胞(又称神经元型NOS,neuronal NOS,nNOS)内,为Ca2+/钙调素依赖型,合成及释放NO量少(pM),cNOS的激活剂有乙酰胆碱、谷氨酸盐、纤维蛋白酶、Ca2+等;iNOS为非Ca2+依赖型,存在于几乎所有的组织细胞中,巨噬细胞和血管平滑肌细胞内含量最多,能够持续大量释放NO(nM),多种细胞因子如α-INF、IL-1、TNF-α、LPS等均可诱导iNOS生成。还原型辅酶Ⅱ及O2是NO合成的辅底物,黄素腺嘌呤二酸(FAD)、黄素单核酸(FMN)、四氢喋呤(BH4)、亚铁血红素是NOS的辅基,直接影响NO的合成;另外,L-Arg类似物如NG-甲基-L-精氨酸(L-NMMA)、NG-硝基-L-精氨酸(L-NAMA)、N-亚胺基乙基-L-鸟氨酸(L-NIO)、NG-硝基-L-精氨酸(L-NNA)及NG,NG-二甲基精氨酸(DMA)均证明有内源性形式存在,可抑制NO的生成。目前,两类NOS在人及鼠类(Rat)染色体上的位置已经明确,故对NOS活性的调控研究已可以上升到基因水平。
NO是一种活性很强的自由基,还具有氧化还原特性,体内半衰期仅3~5s。NO生物效应主要通过靶细胞膜上的受体介导,推测受体可能为酶或酶分子中的Fe2+、铁卟啉或者血红素。NO与受体结合后,激活靶细胞膜上的鸟苷酸环化酶(GC)进而使cGMP合成增加并发挥第二信使的作用,如降低胞内游离钙、扩张血管,抑制血小板聚集和粘附、松驰气道平滑肌等,作用于神经细胞和免疫细胞还发挥神经传导和免疫调节作用。但是过量的NO可灭活三羧酸循环的乌头酸酶、线粒体逆电子体系中的NDAPH脱氢酶和琥珀酸脱氢酶,从而抑制能量合成;过量NO还抑制核糖核苷还原酶而影响DNA复制;尤其是NO与超氧化物离子(O2-)结合或与血红蛋白反应生成过氧亚硝酸根(ONOO-),后者还可继续分解为NO2等自由基,NO2自由基和ONOO-对组织细胞具有直接损伤作用。
2.2 NO的检测方法 由于NO在生物体内含量低,半衰期短,有O2存在条件下极易被氧化,这就给其准确测定带来困难。目前主要采用测定NO的稳定代谢终产物NO2-、NO3-间接反映NO含量的方法。NO3-可用硝酸盐还原酶或镀铜法将其还原为NO2-,再与Griess试剂发生重氮化反应,生成橙红色化合物,λmax=546nm,呈色强度与NO2-浓度成正比。化学发光法[3]根据NO可与臭氧(O3)发生化学反应形成激发态二氧化氮(NO2),后者在返回基态过程中释放能量,部分能量以光子形式发射,利用敏感的光电倍增管来检测光子的发射强度,以此推算NO含量。此法具有高灵敏度和高特异性的优点,尤其适用于呼出气NO含量的检测。但由于存在金属,玻璃,塑料等因素的干扰作用,其临床应用受以一定限制。其它还有高效色谱法,高铁血红素法等,由于需要特殊仪器,操作繁杂,难于在临床推广使用。Griess试剂法测定NO2-灵敏度高,线性好,不需特殊仪器,操作也较简便,适于临床推广使用,也是目前NO研究中应用最广泛的方法。我室研制的一氧化氮(NO)检测试剂盒(单一试剂法)[4]经数位研究人员试用和在国内数家医院推广使用,效果良好。
2.3 NO合成减少与疾病的关系
2.3.1 NO合成不足引起高血压、动脉粥样硬化等血管疾病[6]。健全的血管内皮细胞是维持血管张力、调节血压的基础,基础状态下血管阻力由NO(这里又称皮内细胞舒血管因子,EDRF)控制。长期NO合成不足不仅不能有效扩张血管,还加剧了内皮素(ET)的缩血管作用,使血压升高;NO相对缺乏导致抑制肾素作用下降,抑制平滑肌增生和血小板粘附与聚集能力下降,促进高血压的维持及血栓的形成;长期高盐饮食,NO合成不足,压力-利钠反射减弱,不能有效地利纳、利尿,从而出现高盐引起的高血压。高胆固醇或高脂血症时,内皮细胞内L-Arg生物利用率下降,NOS对L-Arg亲和力下降,同时内皮细胞合成和释放NO2增多,灭活NO加快,特别是氧化脂蛋白更易灭活NO,NO受体信号传递受抑制,NO功能不能得到发挥,不仅使血管收缩,还促进平滑肌增生和激活巨噬细胞与内皮细胞粘附,诱导泡沫细胞形成,促进血小板粘附与集聚,最终导致粥样硬化病变。
2.3.2 慢性病毒性肝炎人NO(血清NO2-)合成减少[5],推测肝炎病毒可能抑制NO合成,从而影响机体的免疫防御。
2.3.3 吸烟可以导致血浆NO(NO2-/ nO3-)浓度降低,并与心、脑及外周血管性疾病发病有关,是动脉粥样硬化及血栓形成的一个主要危险因素。停止吸烟可以使血浆NO浓度增加,且减少心血管疾病的发生率[7]。
2.3.4 孕妇血中NO水平下降是妊娠高血压综合征发病的一个重要环节。但有作者报道[8],妊高征NO水平同于甚至高于正常妊妇。因前者尿NO2-/NO3-与血浆肌酐之比降低,推测为肾功能受损,对NO2-/NO3-排泄能力降低所致。
2.3.5 有些药物如环孢菌素、造影剂、嘌呤霉素、甘油等所致急性肾衰与机体L-Arg相对缺乏或(和)内源性NO不合成不足有关[9]。
2.4 NO合成亢进与疾病的关系
2.4.1 细菌内毒素(脂多糖,LPS)和炎症细胞因子刺激的NO过度产生为败血症性休克病理发生过程中关键性的中介机制[10]。NO合成亢进,使血管阻力下降,而心搏输出正常或增加,因此引起的休克为低阻高排型。病原体直接侵入血流或全身性释放内毒素和外毒素,启动了败血症的一系列反应。内毒素触发巨噬细胞,T淋巴细胞一些中介物质如TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2等,这些炎性细胞因子诱导血管平滑肌及组织巨噬细胞iNOS过度表达,由此大量产生NO,一方面松驰血管平滑肌,另一方面产生细胞毒性而损伤组织。
2.4.2 呼吸道因过敏反应产生的IgE介导呼吸道上皮细胞及炎症细胞合成过NO导致炎症介质释放[11]。NO产生过多,虽可松驰和扩张气管平滑肌,但更重要是扩张血管,增加气道内诱出,并能损伤上皮细胞,因此最终结果是引发气道炎症和气道狭窄,导致哮喘病的发生。
2.4.3 结缔组织可由于其炎症细胞、血管内皮细胞、软骨细胞等合成NO亢进,过多NO不仅破坏软骨细胞,还降解透明质酸酶而导致系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等疾病[12]。
2.4.4 其它 如肝硬化病人因NO合成过多,使体循环门脉系统血管阻力下降,血压降低,门体循环分流而致门静脉高压。Soderman[13]发现,肝功能不全患者过多NO可由呼吸道排出,这将有助于了解肝病患者血管扩张的病理生理机制。另外,胰岛内炎症细胞释放NO过多可破坏β细胞而与糖尿病的发生有关[14]。
3 NO在疾病治疗中的应用
3.1 吸入NO或利用NO供体产生NO作用于靶器官或组织。目前,吸入NO(5-80ppm)治疗与肺功能障碍有关疾病的研究报道已相当普遍。呼吸衰竭、呼吸窘迫综合症,持续肺动脉高压的新生儿(PPHN)成人NO可选择性地扩张肺血管,降低肺血管阻力,而不降低体循环血压,增加PaO2/FiO2值,使病人症状明显改善[15]。但对伴有慢性阻塞性肺疾病患者,吸及NO则加重其气体交换恶化[16]。因过多NO具有损伤组织细胞及氧化成有损伤作用的NO2和N3O4的作用,临床应用必须选择有效的最低浓度。NO供体(NO donor)目前主要有:硝酸酯类、呋喃恶烷类、亚硝基硫醇类、斯德硐亚胺类、硝普钠等。临床常用硝普钠等药物治疗高血压,应用硝酸甘油防止食管下端静脉扩张所致的破裂出血,应用长效扩血管药脉导敏(molsidomine)治疗肝硬化门静脉高压都是通过产生NO松驰血管而获得良好效果。
3.2 口服或输注相关药物调节机本NO合成。L-精氨酸是合成NO的前体,动物实验及初步临床研究表明[17],它对许多疾病(心血管疾病如高血压、高胆固醇血症、充血性心力衰竭等,肾脏疾病如急性肾衰、阻塞性肾病、慢性肾病等,胃粘膜溃疡及肺动脉高压等)具有有益的治疗作用,NOS抑制剂如L-NMMA、L-NNA、L-NAME等可抑制体内NO生成,人工合成NO清除剂如羧基-PTIO能有效清除NO自由基,降低组织细胞NO水平,经动物实验研究表明,对于由于NO生成过多而致的疾病具有治疗或缓解作用[18]。7-硝基吲唑(7-nitro-indazole,7-NI)是Moore等发现的具有较强选择性的nNOS抑制剂。7-NI较其他非选择性NOS抑制更具有优越性,对脑缺血、帕金森症和吗啡戒断症状等病变显示了一定治疗效果[19]。由于作用机制尚未完全明了,NOS抑制剂及NO清除剂的治疗研究仍主要处于实验观察阶段,临床应用研究报道很少。
4 展望
随着对NO作用机制的发现已为许多生命过程与病理现象增加了新的认识。大量事实表明,在探讨众多生物学与医学问题时,我们已没有理由再忽略对NO机制的的了解,其有关问题的阐明将直接为人类的生存不断带来益处。某些NO外源性供体以及NO前体已为一些医学问题的解决提供了帮助,并可能给更多临床重、危、顽症的治疗带新的希望和线索。
由于NO与许多的与器官功能的密切关系,某些有条件的实验室已将NO检测作为临床实验室的常规检测项目。由此也可以预见,NO检测将可能成为心功能、肾功能、肝功能等检查的重要项目之一,为许多疾病的鉴别诊断、病情及预后判断、疗效观察提供更可靠的依据。
NO研究的许多结论还仅是初步的。因为各自的研究方法、条件、标准的不同,有的结论出入较大甚至相互矛盾。NO的计多物理、化学及生物学特性还有待进一步观察,其生命合成、释放、转运、作用、灭活及清除机制还有许多问题需要深入探讨。NO检测方法亟待标准化,人群的正常参考值及各种体液NO检测的临床意义需要明确。与NO相关的各种治疗药物,如L-精氨酸,NO气体,新型NO供体,特异性NOS抑制剂,或者活性氮介质(reactive nitrogen intermediates ,RNI)清除剂亟待开发与供应。
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