摘要：为评价基于选择性水解原理的二种低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的直接测定法的精密度、准确度和特异性，将这二种方法与我国检验学会推荐的聚乙烯硫酸沉淀法。（PVS法）作了比较，并以超速离心分离的HDL和LDL组分验证了对LDL-C测定的特异性与准确性。精密度评价按照NCCLS的EP5-T导则文件的方案进行，对高、低两种LDL-C浓度混合血清所测定的结果表明这二种方法测定LDL-C均有良好的精密度，总CV值一化法3.96-4.42，朗道法0.78-3.19，都可达到临床满意的程度。48份临床标本测定结果（ x±s）分别为3.68±1.23mmol/L（PVS法），3.25±1.11mmol/L(一化法)和3.37±1.21mmol/L(朗道法)，直接测定法与PVS法测定结果的差异无统计学意义。PVS法（ x）与一化法（ y）的回归方程为 y=0.848x+0.121(r=0.9427），与朗道法（ y）的回归方程为 y=0.914x+0.007（ r=0.9353），提示对一般标本的测定，二种直接测定法的结果与PVS法有良好的相关。在混合血清中分别加入不同量的超离心HDL和LDL组分后测定的结果提示一化法和朗道法对LDL-C有较好的特异性，LDL-C有很好的回收，完全不受HDL的干扰。稀释试验的结果表明二种直接测定法均有良好的线性，线性范围至少可达9.28mmol/L。结论是：以选择性水解法直接测定LDL-C具有较好的精密度，对LDL有很好的特异性，适应自动分析，可以真实反映LDL-C的水平，值得有临床推广应用。
低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）是一个重要的冠心病危险因素，已成为对心血管病临床有重要意义的血脂指标之一，LDL-C的测定在各级实验室中逐渐开展。在早几年以前，国内多数临床实验室以F公式计算血清中的LDL-C浓度，但F公式仅是一个经验公式，难以得到准确的结果，尤其在高血脂的病人中更难得到。一种类似于化学沉淀法测定高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的选择性沉淀法-PVS测定法发展出来后，因成本低，操作简单受到临床实验室的欢迎，也被中华检验学会作为常规测定方法而推荐[1]，但此法因要离心分离沉淀的操作而难以适合自动分析，限制了此法的临床应用。最近几年来已发展出可均相的对LDL-C作直接测定的方法[2-3]，其原理相似，在反应体系中有选择地使LDL-C在显色反应中被测定，但其中一类是以α-环糊精、硫酸葡聚糖、和聚氧乙烯-聚氧丙烯封闭共聚多醚（POE-POP）抑制非LDL脂蛋白与胆固醇酯酶（CHE）和胆固醇氧化酶（CHOD）的反应，从而仅使LDL-C被酶水解并测定[2]，而另一类是以不同的表面活性剂的双试剂使非LDL-C与LDL-C分二步水解，并使第二步LDL-C的水解反应显色测定[3]，其商品化试剂盒以日本第一化学株式会社（DAICHI）、英国朗道（RANDOX）的产品为代表。罗氏公司（ROCHE）曾有以两性离子去污剂体系的直接法试剂盒，后来也改成选择性表面活性剂体系。
均相直接测定法一问世，因适合自动分析受到临床实验室的欢迎，但对其的评价文献尚不多见[3，4]。初步认为LDL-C直接测定法所得结果符合美国国家胆固醇教育计划（NCEP）规定的准确度与精密度要求[5]，但尚有一些有待完善之处。我们以超速离心法分离的HDL和LDL组分观察了直接测定法的准确度与可靠性。
材料与方法
1.标本：48份血脂测定标本为本院的血脂门诊病人标本，早晨空腹采血，室温自行凝固后经离心分离血清，当天完成总胆固醇（TC）、HDL-C和甘油三酯（TG）测定，48份标本的TC平均浓度为5.93±1.37(3.40～9.03)mmol/L，TG的平均浓度为2.04±1.04(0.45～5.88)mmol/L，HDL-C的平均浓度为1.56±0.46(0.68～2.52)mmol/L。
2.混合血清：将无黄疸、无溶血、无严重脂浊的正常空腹血清数份混合，作为正常值混合血清，此混合血清的TC浓度为5.07mmol/L，TG浓度为1.43mmol/L。另收集高脂的血清作为高值混合血清，此混合血清的TC浓度为6.66mmol/L，TG浓度为2.43mmol/L。这二份血清用作精密度的测定。
3.仪器与试剂：所有的血脂和LDL-C的测定无在日立7060型自动分析仪上进行，所用的试剂见下面各条所述。
4.血脂测定方法：TC测定采用COD-PAP法，TG测定采用GPO-POP法，试剂均为上海科华东菱公司产品，校准品是试剂盒内所带，操作按说明书提供的参数由晶立7060分析仪自动进行。
HDL-C测定采用化学修饰的直接测定法，试剂为上海生物制品研究所产品。
HDL和LDL脂蛋白组分以序列超速离心法分离，由杨昌国教授惠赠。经抗apoA1和抗apoB抗体检查，LDL组分中不含有apoA1，apoB含量286mg/dl，HDL组分中尚有apoB（含量14mg/dl），apoA1含量194mg/dl。
LDL-C的测定方法：
聚乙烯硫酸盐法（PVS法）：方法原理按文献1，试剂盒为宁波慈城试剂厂产品，校准品是试剂盒内所带标示值为4.09mmol/L的血清型制剂。操作按说明书进行，离心分离沉淀后上清液和血清于日立7060分析仪酶法自动测定胆固醇，计算得出LDL-C。
直接测定法I（一化法）：方法原理按文献3，试剂盒为日本第一化学株式会社（DAICHI）产品，校准品是DAICHI的LDL-C测定专用校准品，批号120KCW，标示值106mg/dl。按说明书提供的参数由日立7060分析仪自动直接测定。
直接测定法II（朗道法）：方法原理同上，试剂盒为英国RANDOX产品，校准品亦是RANDOX的LDL-C测定专用校准品，批号786CH，标示值3.16mmol/L。按说明书提供的参数由日立7060分析仪自动直接测定。
F公式法：根据Friedewald公式LDL-C（mmol/L）=(TC-HDL-C-TG/2.2)计算。
结果与讨论
1.三种LDL-C测定的精密度精密度分析严格按NCCLS的EP5-T2导则文件[6]的方案进行。将高、低两种混合血清以三种LDL-C测定方法测定，每天上下午各测定一次，每次平行测定双份，连续测10天，所得结果在EXCEL电子表格上按EP5-T2规定的方法统计，得到三种方法的各个CV值如表1。
表1 四种LDL-C测定方法的精密度
| 方法 |
均值mmol/L |
批内CV% |
批间CV% |
日间CV% |
总CV% |
| 低值血清 |
| PVS法 |
3.15 |
1.35 |
1.80 |
2.60 |
2.61 |
| 一化法 |
2.95 |
0.78 |
2.72 |
3.99 |
4.47 |
| 朗道法 |
3.02 |
0.21 |
0.43 |
0.71 |
0.78 |
| 高值血清 |
| PVS法 |
4.11 |
0.92 |
2.47 |
4.00 |
4.42 |
| 一化法 |
3.74 |
0.65 |
1.01 |
3.87 |
3.96 |
| 朗道法 |
3.99 |
0.49 |
1.16 |
3.06 |
3.19 |
上面的结果表明这三种方法测定LDL-C均有良好的精密度，总CV值都可达到临床满意的程度，二种直接测定法的结果与PVS法比较差别均无显著意义（p＞0.1）。
2.二种直接法测定LDL-C的结果与PVS法的比较
图1一化法与PVS法的相关图2.朗道法与PVS法的相关
方法间的比较按NCCLS的EP9-A导则文件[7]的方案进行。以PVS法作为对照方法，48份标本血清每份以反序测定二次，所有结果在EXCEL电子表格上按EP9-A的要求作统计处理。经检查没有发现离群点。二种直接测定法与PVS法的对照结果参见图1和图2，直接测定法与PVS法有良好的相关性。48份标本的测定结果（分别为3.68±1.23mmol/L(PVS法)，3.25±1.11mmol/L(一化法)和3.37±1.21mmol/L(朗道法)。二种直接测定法与PVS法测定结果的均值虽有差异，但统计分析的结果表明差异没有统计意义，P值均大于0.05。
二种直接法之间的差异也没有统计意义。
3.二种LDL-C测定方法的特异性取TC浓度为5.25mmol/L的正常人混合血清，其LDL-C的浓度为2.94mmol/L（朗道法），另取超速离心分离的HDL和LDL组分，其胆固醇含量分别为7.54mmol/L和10.35mmol/L，因为在HDL组分中检测到apoB，所以再以直接法检测了HDL-C和LDL-C，结果如表2。
按下表所列的比例分别在混合血清中加入不同量的脂蛋白组分，并计算TC与LDL-C的理论值。
*指与计算值的偏差
本节的实验设计实际上是一个回收试验，以与理论计算值的偏差大小评价回收的情况，从而判断直接测定法对LDL反应的特异性。表3的结果表明，9个混合标本的TC实测值与计算值都很接近，验证了对超离心HDL和LDL组分的胆固醇定值的可靠性与配比的准确。一化法和朗道法对三组九个标本LDL-C的测定定值与计算值的偏差范围在-4.57%-2.87%之间，表明对LDL-C有较好的回收，且不受其他脂蛋白的影响，对LDL-C有较好的特异性。
3.稀释试验
将一份以朗道法测定LDL-C为9.28mmol/L的血清以去脂血清作稀释后以三种方法测定LDL-C，此去脂血清的LDL-C含量为0。测定结果见表和图3。
图3 直接法测定LDL-C的线性
上述结果表明二种方法均有较好的线性，与计算值的相关系数分别为0.9983（一化法）和0.9992（朗道法），其线性范围至少可达9.28mmol/L。
5.直接法与F公式的评价
48例临床标本同时测定TC、TG和HDL-C，以F公式计算LDL-C。并以TG＜2.50mmol/L和TG|2.50mmol/L为标准将48例标本分成二组，结果如下：表5直接法与F公式结果的相关TG＜2.50mmol/L与F公式的≥2.50mmol/L与F公式的n="35"相关系数n="13"相关系数F公式3.50±1.313.29±1.24一化法3.30±1.170.98513.01±0.950.6838朗道法3.42±1.290.98403.43±1.220.7532F公式对于高甘油三酯血症时的应用有限制已是不争的事实，本文的结果表明在TG＜2.50mmol/L的标本中，F公式计算结果与直接法结果的相关性还是比较好的，且均值间的差异无统计意义，而在大于2.50mmol/L的标本中，二者的相关性就比较差。直接法可以准确测定高甘油三酯血症标本的LDL-C也是直接法的优点之一。
小结
LDL-C直接测定法由于适合作自动分析，可由仪器一步测定，受到了临床实验室的欢迎。经多方面的评价，一般认为以聚阴离子和表面活性剂的选择性作用为原理的LDL-C直接测定法有较好的精密度，测定的准确度也是可以信赖的。
我们的研究确认一化和朗道提供的商品试剂盒有较好的精密度，以超离心分离的脂蛋白组分的测定结果提示这二种直接测定法对LDL-C有良好的特异性，对一般临床标本的测定结果与PVS法接近并有良好的相关，说明经过方法本身的系统校正，二种直测定法所测得的结果可以反映LDL-C的水平。
结合直接测定法的其他优点，我们认为LDL-C的直接测定法对临床生化实验室开展常规的LDL-C测定是适用的方法。
参考文献
1.中华医学会检验学会血脂测定推荐方法五、血清低密度脂蛋白胆固醇测定法（草案）中华医学检验杂志. 1995，6：381
2. Sugiuchi H, Irie T, Uji Y, et al. Homogeneous assay for measuring low-density lipoprotein choles-terol in serum with triblock copolymer and a-cyclod-extrin sulfate. Clin Chem 1998, 44(3):522-531.
3. Yu HH et al. Am J Cardiol 1997, 80: 1295
4. Rifai N, Iannotti E, DeAngelis K, et al. Analy-tical and clinical performance of a homogeneous enzy-matic LDL-cholesterol assay compared with the ultrace-ntrifugation-dextran sulfate-Mg2+ method. Clin Chem1998, 44:1242-1250.
5. Bachorik PS and Ross JW. NCEP Recommendations for measurement of LDL-cholesterol: executive summa-ry. Clin Chem 1995, 41:1414-1420
6. NCCLS (EP5-T2). Precision performance of clinical chemistry devices second edition; Tentative guideline (1992)
7. NCCLS (EP9-A). Method Comparison and Bias Estima-tion Using Patient samples; Approved Guideline (1995).