摘要 目的： 建立测定血浆同型半胱氨酸的高效液相色谱（HPLC）方法。方法： 血浆同型半胱氨酸经巯基乙醇还原后用碘乙酸封闭巯基，再与邻苯二甲醛（OPA）反应完成衍生化；以磺基同型半胱氨酸为内标，经C18反相柱进行色谱分离，荧光检测器测定结果。结果： 测定线性范围达150μmol/L，最低检测限为1.0 μmol/L，日内不精密度3.7%～4.2%；日间不精密度3.8%～4.3%；方法回收率93%～102%。结论： 本方法可用于临床实验室测定血浆同型半胱氨酸水平。 关键词： 同型半胱氨酸；邻苯二甲醛；高效液相色谱 同型半胱氨酸（HCY）为含巯基氨基酸，是胱硫醚和蛋氨酸转硫化和甲基化代谢旁路中形成的中间体。自60年代初在尿中首次被发现以来，同型半胱氨酸被认为与多种先天性代谢缺限有关，如胱硫醚β合成酶（EC4.2.1.22）缺乏是已知的造成高同型半胱氨酸尿症的原因。最近，人们又发现高同型半胱氨酸血症是发生外周血管、脑血管和冠状动脉血管疾病的危险因素之一，这是因为同型半胱氨酸不仅可影响脂类代谢，还可通过多种其他途径诱发心血管疾病［1］。据调查，相当大比例的人群面临高同型半胱氨酸血症的危险，尤其是当食物中叶酸和维生素B12摄入不足时更是如此。这些说明，遗传因素、环境因素、叶酸及VB12摄取量都与同型半胱氨酸血症有关。 测定同型半胱氨酸的常用方法是高效液相色谱（HPLC），对还原型同型半胱氨酸的荧光衍生物或使用电化学检测器直接测量。目前，同型半胱氨酸的测定方法还有荧光偏振免疫分析（FPIA）和酶联免疫吸附实验（ELISA）。这两种方法是通过特异性的S腺苷同型半胱氨酸水解酶催化同型半胱氨酸转变为S腺苷同型半胱氨酸，再利用单克隆抗体技术进行检测。本实验在参考国外有关文献的基础上［2，3］，对样本处理和色谱条件进行了适当的改进，筛选出适宜的内标物，建产立了血浆同型半胱氨酸测定的HPLC方法，并已试用于临床。 材料与方法 一、仪器
Waters 510液相色谱泵，Shimadzu RF551荧光检测器，Waters nova-Pak ODS色谱柱（3.9 mm×150 mm）及保护柱，PC800色谱工作站；Millipore过滤器及0.45μm滤膜。
二、试剂
β巯基乙醇、同型半胱氨酸、碘乙酸、邻苯二甲醛（OPA）为Sigma公司产品；磺基同型半胱氨酸（Homocysteic acid）为Aldrich公司产品；四硼酸钠、乙腈（色谱纯）、乙酸钠、冰乙酸为北京化学试剂公司产品。上述化学试剂均为分析纯。3.4%碘乙酸工作液：碘乙酸3.4 g溶于0.5 mol/L硼酸盐缓冲液（pH 11.0）100 ml。OPA衍生化试剂：OPA60 mg溶于1.0 mol/L硼酸盐缓冲液（pH 11.0）8 ml，加甲醇1 ml，巯基乙醇1 ml。
三、流动相
流动相A：0.05 mol/L乙酸盐缓冲液，pH 6.8，含8%乙腈；流动相B：100%乙腈。流动相在使用前需经Millipore过滤器处理。
四、内标
1.0 mmol/L磺基同型半胱氨酸水溶液。
五、样本采集与处理
样本采用EDTA抗凝的静脉血，样本采集后10 min内离心分离血浆（4℃，2500 g×10 min）；如在8 h内不能完成分析，样本应置-20℃保存。样本前处理：取血浆150μl，加入10%巯基乙醇水溶液10 μl及内标液4 μl，混匀，2 min后加入100 g/L三氯乙酸溶液100 μl，混匀，离心（5 000 g×15 min）。取离心上清液50μl，加碘乙酸工作液50 μl，混匀；2 min后，加1.55 mol/L氢氧化钠溶液10μl和OPA衍生化试剂40 μl，混匀；1 min后取5 μl进样分析。
六、色谱条件
样本分析采用梯度洗脱程序，初始状态：A相为100%，B相为0；第6～8 min：A相由100%降至10%，B相由0升至90%；第12～13 min：A相由10%升至100%，B相由90%降至0，恢复初始状态。泵流速为1.3 ml/min，荧光检测器的激发波长为335 nm，检测波长为455 nm。
结果
1.色谱结果：在上述色谱条件下，样本中的内标和同型半胱氨酸的保留时间分别为2.8和4.9 min，能与其他峰有效地分离（图1，2）。
2.检测限和线性范围：当以信噪比(S/N)=2为最低检出限时，本方法检测同型半胱氨酸的最低浓度为1μmol/L。配制同型半胱氨酸浓度分别为6、15、30、75和150 μmol/L的样本进行测定，结果表明，同型半胱氨酸浓度在6～150μmol/L范围内有良好的线性结果，r2为0.998 8（图3）。
3.精密度：取3份不同浓度的血浆样本，分别测定日内和日间重复性，结果表明，本方法的日内不精密度为3.7%～4.2%，日间不精密度为3.8%～4.3%（表1）。
图1 内标及Hcy标准品图谱(峰1：内标；峰2：同型半胱氨酸)
图2 血浆标本的图谱(峰1：内标；峰2：同型半胱氨酸)
图3 HPLC法测定血浆同型半胱氨酸标准曲线
表1 HPLC法测定血浆同型半胱氨酸精密度试验
| 样本 编号 |
日内不精密度(n=12) |
日间不精密度(n=10) |
| x±s(μmol/L) |
CV(%) |
x±s(μmol/L) |
CV(%) |
| 1 |
12.3±0.52 |
4.2 |
13.3±0.57 |
4.3 |
| 2 |
54.7±2.24 |
4.1 |
55.8±2.32 |
4.2 |
| 3 |
106.7±3.92 |
3.7 |
105.8±4.03 |
3.8 |
4.回收率：在同一份样本中分别加入不同量的同型半胱氨酸进行测定，结果表明方法的回收率为93%～102%（表2）。
5.参考值范围：随机选取健康男性40人，女性40人，平均年龄36岁（年龄范围15～73岁），测定血浆同型半胱氨酸浓度水平。结果表明，健康人血浆同型半胱氨酸浓度参考值范围为4.5～14.0μmol/L（x±2s），均值为9.3μmol/L。
表2 HPLC法测定血浆同型半胱氨酸回收率
| 样本 号 |
Hcy浓度(μmol/L) |
回收率 (%) |
| 原浓度 |
加入量 |
理论值 |
实测值 |
| 1 |
13.6 |
— |
— |
— |
— |
| 2 |
13.6 |
10 |
23.6 |
21.9 |
93 |
| 3 |
13.6 |
20 |
33.6 |
31.9 |
95 |
| 4 |
13.6 |
50 |
63.6 |
64.9 |
102 |
| 5 |
13.6 |
100 |
113.6 |
112.1 |
98.7 |
讨论
1.血浆同型半胱氨酸浓度测定近年来受到广泛重视，临床上可作为硬化性心血管疾病的危险指标，同型半胱氨酸浓度升高的程度与疾病的危险性成正比。根据同型半胱氨酸的代谢特点，维生素B12和叶酸缺乏、以及遗传性N5甲基四氢叶酸转甲基酶、胱硫醚-β-合成酶基因缺陷等与同型半胱氨酸浓度密切相关，这些因素与心血管疾病的关系正在研究之中。
2.由于同型半胱氨酸在体内约有70%以二硫键形式与蛋白质结合，故需用β巯基乙醇为还原剂，打开二硫键，此步反应30 s即可完成，在2 h内进行去蛋白操作不影响结果。
3.由于OPA衍生化产物的荧光强度与pH值有密切关系，故采用pH=11.0的硼酸盐缓冲液，并调高浓度，以增强其缓冲能力。在实验条件下，OPA衍生化产物可稳定30 min。
4.OPA作为氨基酸的衍生化试剂已有多年，方法成熟，其对氨基的衍生化速度快，样品准备时间短，衍生化反应的温度要求不高，成本较低，适合在国内推广应用。
作者单位： 郭健（100730卫生部北京医院 卫生部临床检验中心) 肖飞（100730 卫生部北京医院 卫生部临床检验中心) 唐志毅（100730 卫生部北京医院 卫生部临床检验中心检验科） 参考文献
1，David A. Homocysteine vs cholesterol competing views, or a unifying explanation of arteriosclerotic cardiovascular disease? Lab Med, 1998,29:410-417.
2，Khim Kuo, Rachel Still, Sara Cale. Standardization (External and internal) of HPLC assay for plasma homocysteine. Clin Chem, 1997,43:1653-1655.
3，Hyland K, Bottiglieri T. Measurement of total plasma and cerebrospinal fluid homocysteine by fluorescence following high-performance liquid chromatography and precolumn derivatization with o-phthaldialdehyde. J chromatogr, 1992,579:55-62.