摘要 为了制备淀粉酶测定的参考品，从正常人尿液中提取了α-淀粉酶(Amy)并对其特性进行了研究。该提制品淀粉酶的比活性达84.3 kU/g蛋白，几乎不含其它杂酶(测不到ALT、AST、LD、CK、GGT、ChE、ALP活性浓度)。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示一条Amy区带。其催化特性和人血清Amy非常相似，用亚乙基封闭的G7-pNP(EPS)作底物，偶联多功能α-葡萄糖苷酶测定其米氏常数为0.189 mmol/L。利用琼脂糖凝胶电泳，碘-淀粉显色，该提取物至少被分为S2、P2两条活性区带。本研究为今后进一步研制淀粉酶测定参考品建立了基础。 Study on purification and properties of α-amylase from human urine
ZHANG Xiaojie,MENG Zei
(Department of Medical Laboratory Science,PLA,Nanjing General Hospital of Nanjing Command,Nanjing 210002)
Abstract For the purpose of preparing the reference material of α-Amylase,the purification and properties of Amy in human urine were studied.The purified Amy has a specific activity of 84.3 kU/g of protein.It was almost free of contaminating enzymes.After polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulphate,only one band of Amy could be seen.The final purified Amy was found to be very similar to the human serum Amy in catalytic properties.The apparent Michaelis constant of the purified Amy was 0.189mmol/L with ethylidence-blocked G7-pNP(EPS)as substrate and with multifunctional α-glucosidase as auxiliary enzyme.Agarose gel electrophoresis was performed and isoenzymes were developed with iodine-starch method.At least two distinct enzymatic bands,S2 and P2 were found.This research is intended to be a fundament to prepare a reference material for the measurement of α-amylase. Key words α-Amylase；reference material；urine 淀粉酶(Amy，EC3.2.1.1)属水解酶类，分为α、β两类，人体中淀粉酶属α-淀粉酶，主要由胰腺和唾液腺分泌。Amy活性的准确测定依赖于测定方法的标准化。Amy的测定方法不下200种，德国Boehringer Mannheim(BM)公司推出了新底物4，6-亚乙基-4-硝基酚-α-庚糖偶联多功能α-葡萄糖苷酶的测定方法。IFCC根据这一新体系，提出了Amy测定的参考方法。没有参考品或标准品，仍不能确定测定结果是否正确。欧共体标准局(BCR)的CRM476是从人胰腺中提制的Amy参考品，其动力学特性与人血清基本一致［1］。我国目前尚无酶参考品。由于胰腺取材困难，并且牵涉道义和法律问题，故我们采用正常人尿液提取Amy。与从胰腺中提取淀粉酶相比，不仅取材方便，而且尿液和血清中Amy的成分基本一致，为今后制备酶的参考品建立了基础。 1 材料和方法 1.1 仪器 由自动部分收集器(上海沪西生化仪器厂产，BSZ-160型)、核酸蛋白检测仪(浙江永嘉电器厂)及海尔冷藏陈列柜等组装的层析系统。日立高速冷冻离心机(20PR-520)。日立7150型生化分析仪。DYY-Ⅱ型稳压稳流电泳仪和DYY-Ⅱ型琼脂糖水平电泳槽(北京六一仪器厂)。Beckman700分析系统。Mini-PROTEAN型垂直板型电泳仪(BIO-RAD公司)。透析浓缩装置(本室组装)。 1.2 试剂 丙烯酰胺(Sigma),甲叉双丙烯酰胺(Aldrich),四甲基乙二胺(TEMED,Sigma),十二烷基硫酸钠(SDS,Serva),DEAE-Sephacel(Pharmacia),CM-葡聚糖凝胶C-50(Pharmacia),葡聚糖凝胶G-75(Pharmacia),2-氨基-二甲基-1,3丙二醇(Fluka),琼脂糖(Serva),4,6-亚乙基-4-硝基酚-α-庚糖和α-葡萄糖苷酶(BM公司),Tris、过硫酸铵、硫酸铵、总蛋白标准液、顺丁烯二酸、可溶性淀粉、甘氨酸、巴比妥、巴比妥钠、磷酸盐、醋酸盐、氯化钠及氯化钙等(均为国产)。 1.3 原材料 正常人的新鲜尿液约50 kg。 1.4 方法
1.4.1 提纯方法 参考Gubem G等［1］的方法加以改进，步骤如下：
收集正常人新鲜尿液约50 kg，3号砂芯漏斗减压过滤后，用透析浓缩装置将其浓缩。共得浓缩尿2170 ml，pH接近7.0。用40%饱和度(NH4)2SO4沉淀后(室温、4小时)，4℃、6000×g离心25分钟，去上清。用约200 ml含1 mmol/L CaCl2的Tris-HCl缓冲液(10 mmol/L，pH 8.8)溶解沉淀物，4℃、10 000×g离心20分钟。取上清，用上述Tris-HCl缓冲液透析此上清液至透析液不含SO2-4为止。共得透析液84 ml，置4℃冰箱中保存。
在0.8×20 cm的DEAE-Sephacel柱中,用不含NaCl的Tris-HCl缓冲液平衡后上样,用含0～0.5 mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液梯度洗脱。收集酶活力1000 U/L以上的部分,合并后用含NaCl 10 mmol/L、CaCl2 1 mmol/L、pH 4.2、10 mmol/L的醋酸盐缓冲液透析至pH下降到4.2左右。在2 cm×40 cm的CM-Sephadex C-50柱中,用醋酸盐缓冲液平衡后上样,用含NaCl 0～0.4 mol/L的醋酸盐缓冲液洗脱,收集淀粉酶活力1000 U/L以上的部分,浓缩后用pH 7.1、40 mmol/L的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液透析一天。上样于用该磷酸盐缓冲液平衡的1.6 cm×100 cm的Sephadex G-75层析柱，用同一缓冲液洗脱。收集洗脱液，合并淀粉酶活力曲线峰值部分，共66 ml，置－20℃冰箱中保存。纯化后的淀粉酶比活达到84.3 kU/g蛋白。
1.4.2 鉴定方法 提纯的淀粉酶在日立7150型自动生化分析仪上作其它各种酶的检测(上海长征公司Trace试剂盒)。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)证实各步分离提纯的效果。琼脂糖凝胶电泳法分离淀粉酶同工酶，电泳结束后，碘-淀粉法行同工酶染色。
1.4.3 分析方法 实验过程中多数情况下采用碘-淀粉比色法［5］测定淀粉酶的活力，而分步提纯的各阶段产物的活力则在7150型生化分析仪上进行测定(上海长征公司Amy试剂盒)。蛋白质浓度测定用Lowry法［9］。α-淀粉酶米氏常数(Km)的测定用连续监测法。实验方法如下：用pH 7.1的PIPES缓冲液［11］配制各种浓度的EPS(0.05～2.0 mmol/L)，取EPS 250 μl与过Sephadex G-75后的样品6 μl混合，再加入多功能的α-葡萄糖苷酶(8 kU/L)50 μl，混合后用Beckman700分析系统于37℃测定其吸光度的变化。延迟时间120 s，读数时间90 s，波长405 nm，常数(F)为4820［11］。用Lineweaver-Burk双倒数作图法计算Km值。
最适pH的测定用含EPS 2.0 mmol/L的PIPES缓冲液，pH调整为6.1～7.5，其它测定步骤与Km的测定相同。
2 结果 2.1 提纯步骤及结果见表1。 表1 正常人尿液中α-淀粉酶的提纯 Table 1 α-amylase purification from human urine
| Purification stage |
Total catalytic acty (U) |
Total protein mass (g) |
Specific catalytic acty (kU/g) |
Recovery (%) |
Purification fold |
| Crude extract |
2166 |
5.4 |
0.4 |
100 |
1.0 |
| Purification with(NH4)2SO4(40%saturation) |
1472 |
0.33 |
4.5 |
68 |
11.3 |
| Chromatography on DEAE -Sephacel |
1203 |
0.14 |
8.6 |
56 |
14.8 |
| Chromatography on CM -Sephadex C-50 |
178 |
0.009 |
19.8 |
8.2 |
49.5 |
| Chromatography on Sephadex G-75* |
253 |
0.003 |
84.3 |
11.7 |
210.8 |
*By way of the stage,the activity of Amy was higher than previous step,it was probably that some inhibitors were cleared thoroughly or Amy was activated ulteriorly 2.2 提制物的纯度 图1为提制物经过Sephadex G-75凝胶层析时的洗脱曲线，α-Amy活力呈现单一的洗脱峰。 纯化后α-淀粉酶的比活为84.3 kU/g蛋白。在日立7150型生化分析仪上未检测到ALT、AST、ALP、CK、ChE、GGT和LDH。 Figure1 Elution pattern of urine α-Amylase from Sephadex G-75 chromatography 图1 尿α-淀粉酶Sephadex G-75洗脱图
各步分离提纯的效果用SDS-PAGE证实。过Sephadex G-75后的提纯物显示一条主区带，紧靠主区带有一条几乎可以忽略不计的次区带。其相对分子量分别为：57 540和63 100。主区带的分子量与CRM476的相一致，次区带的分子量则与大多数文献报道的唾液型Amy相一致。CRM476未报道其次区带的相对分子量。
1 2 3 4 5
1：Crude extract 2：(NH4)2SO4(40%saturation) 3：DEAE-Sephacel peak 4：Sephadex G-75 peak 5：Molecular mass markers
The efforts of different purification steps were checked by polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulphate(SDS-PAGE).The purified α-Amy from Sephadex G-75 chromatography shows a major band with a relative molar mass of 57 540,as descriptive in CRM 476.The relative molar mass of a negligible minor band near the major band was 63 100,as the salivary amylase reported by many references.CRM476 didn‘t reported the relative molar mass of the minor band
Figure2 SDS-PAGE of different steps in the purification procedure 图2 分步提纯各阶段产物的SDS-PAGE图谱
2.3 同工酶电泳 淀粉酶同工酶经电泳分离碘显色后，背景呈深蓝色，同工酶作用区域不着色，出现数条无色透明或半透明区带(图3)。 From the top to bottom:saliva,urine extract,pancreolysis dialysate,human serum,human urine Figure3 Electrophoretograms of Amy isoenzymes 图3 淀粉酶同工酶电泳图谱 2.4 米氏常数 测定尿液中提纯的Amy及一份Amy含量较高的血清的米氏常数。结果见表2。 表2 尿提纯Amy及血清Amy对底物的米氏常数(mmol/L) Table2 Apparent Michaelis-Menten constant(Km,mmol/L)of α-Amy purified from urine and human serum for EPS and pNP-G7-B
| Sample |
Author (EPS) |
Reference［1］ (pNP-G7-B) |
| Human serum |
0.1398 |
0.200±0.065 |
| Urine extract |
0.1890 |
— |
| Human pancreatic dialysate |
— |
0.207±0.061 |
3 讨论
我们从正常人尿液中提制的Amy,其组成和人血清中的非常相似,均含有胰腺型淀粉酶(P-Amy)和唾液型淀粉酶(S-Amy)。稍有不同的是正常人血清S-Amy＞P-Amy，而尿则相反［12］。急性胰腺炎患者，其所含的P-Amy＞S-Amy，故用尿液作原料提取Amy更有利于临床应用。最近日本有从尿液中提取淀粉酶的报道，但它开始即用12%饱和度(NH4)2SO4直接离心沉淀60 kg的尿液，这在实验室是难以做到的。该法用简单的一步层析法，我们如法操作未能得到高比活的酶制品。本法先将尿液浓缩，参考BCR从人胰中提纯Amy的方法，经过改进，得到了满意的效果。
本法提纯的α-Amy的比活为84.3 kU/g蛋白，高于欧共体标准局的Amy参考品CRM476的比活(52.9 kU/g蛋白)。并且不含ALT、AST、ALP、CK、ChE、GGT、LDH。CRM476中含有微量的三酰基甘油酯酯酶(我们未做此酶)和LDH。
用亚乙基封闭的G7-pNP(EPS)作底物并偶联多功能α-葡萄糖苷酶测得尿提纯Amy及血清Amy的米氏常数分别为0.1890和0.1398 mmol/L，在同一个数量级之中，相差无几。欧共体标准局采用性质与EPS类似的苯亚甲基封闭的G7-pNP作底物研究人血清Amy的动力学，得Km＝0.200±0.065 mmol/L(n＝5)，我们提纯的尿Amy的米氏常数在此范围内。这表明：我们提纯的尿Amy与人血清Amy的动力学特性相一致，对今后用此提纯物研制稳定的参考品十分有利。
〔衷心感谢宁波市临床检验中心杨昌国主任为本研究提供的淀粉酶测定(EPS法)试剂盒及有关试剂。感谢本科工作人员提供尿液和血清标本及协助部分工作。〕
*本研究为军队医药卫生科研基金资助课题(96M020)
**现在工作单位：江苏省妇幼卫生保健中心
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