【摘要 】 目的 建立一种酶学分析法以测定血清无机磷的含量。方法 血清无机磷与次黄嘌呤核苷在嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)的催化下，生成次黄嘌呤和核糖-1-磷酸，黄嘌呤氧化酶氧化次黄嘌呤生成尿酸和过氧化氢，过氧化氢与4-氨基安替比林和2，4，6-三溴-3-羟基苯甲酸在过氧化物酶的作用下，生成红色产物，在505 nm有最大吸收。结果 线性范围为0.25 ～5.0 mmol/L，批内和批间平均变异分别为1.17%和2.79%，平均回收率为103.4%，与紫外分光光度法比较，相关系数r=0.998，Y=1.056X-0.052。结论 采用了2，4，6-三溴-3-羟基苯甲酸的方法灵敏、准确、简便、快速、适合于半自动和全自动生化分析仪。 A enzymatic method for the determination of inorganic phosphate in serum Hu Hongyan, Chui Yunlong, Zhou Deyong et al. General Hospital of Chinese People′s Armed Police, Beijing 100039 【Abstract 】 Objective To develop a new enzymatic method for the determination of inorganic phosphate in serum.Methods Purine nucleoside phosphorylase and xanthine oxidase were used as indicator enzymes, then the generated hydrogen peroxide was measfured by use of peroxidase with 2, 4, 6-tribromo-3-hydroxybenzoic acid and 4-aminoantipyrene, to give a pink product that absorbed maximally at 505 nm.Results The standard curve for the assay was linear from 0.25 mmol/L to 5.0 mmol/L. The average between-run and within-run CVs were 1.17% and 2.79%. The average recovery was 103.4%. A good correlation was shown as compared with the ultraviolet method (Y=1.056X-0.052,r=0.998, n=40).Conclusions This method was characterized by the use of 2, 4, 6-tribromo-3-hydroxybenzoic acid. The advantages were accurate, sensitive, convenient, swift and suitable for automation. 【Key words 】 Inorganic phosphates Xanthine oxidasev Colorimetry 由于人体的磷目前还不能直接测定，血清无机磷的检测实际上是分析磷酸盐阴离子。国内常用的分析方法有：苯氨萘-8-磺酸(ANS)钼蓝比色法、孔雀绿直接显色法、紫外分光度法等。近年来国外有用酶联反应进行测定，使用糖原磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶和葡萄糖6-磷酸脱氢酶，最后生成还原型辅酶Ⅱ(NADPH)，在340 nm监测。因此法要求指示酶较多，试剂来源困难，难以普及。我们利用合成的Trinder反应新色原，偶联黄嘌呤氧化酶，建立了一种酶联比色法测定血清无机磷，该法血清标本用量少，操作简便，结果稳定，与紫外分光光度法相关性好，适合于各种生化分析仪批量测定。 材料与方法
一、仪器
1.实验主要仪器为：自动生化分析仪(Abbot, EPX)，电子天平(Metter, AE163)和半自动生化分析仪(EOS，880)。
二、试剂
1.酶混合液：含次黄嘌呤核苷(上海东风生化试剂厂生产)0.30 mmol/L；嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)100 U/L，黄嘌呤氧化酶(XOD)20 U/L，过氧化物酶(POD)(此三酶为Sigma公司产品)2 000 U/L；4-氨基安替比林(北京化工厂生产)1.0 mmol/L。
2.色原剂溶液：2，4，6-三溴-3-羟基苯甲酸(TBHBA)10 mmol/L。
3.无机磷标准液为1.5 mmol/L磷酸氢二钠溶液。
三、反应原理
1.磷酸盐阴离子与次黄嘌呤核苷PNP的催化下，生成次黄嘌呤和核糖-1-磷酸。
2.黄嘌呤氧化酶氧化次黄嘌呤生成尿酸和过氧化氢。
3.过氧化氢以Trinder反应呈色，吸光度的变化与磷酸盐阴离子的浓度成比例。
四、全自动生化分析仪的测定参数
1.测定方式：采用标本空白终点法，波长505 nm，反应温度为37℃；读数时间为600秒。先加入酶混合液。250 μl，60秒后加入标本10 μl，经温育120秒后加入色原剂试剂25 μl。
2.测定标准：标准1：0.25 mmol/L；标准2：0.5 mmol/L；标准3：1.0 mmol/L；标准4：2.0 mmol/L。
结果
1.PNP浓度的选择：以Tris缓冲液配制不同浓度PNP溶液，其他条件不变，在EOS880半自动生化分析仪上，测定吸光度(A)的变化，实验结果表明，以PNP浓度在100 U/L时，A值最大。
2.XOD浓度的选择：配制不同浓度黄嘌呤氧化酶溶液，其他条件相同，观察XOD浓度对反应的影响。结果表明，当XOD浓度为20 U/L时，有最大的吸光度值。
3.次黄嘌呤核苷浓度的选择：配制0.05～0.5 mmol/L梯度的次黄嘌呤核苷溶液，其他条件不变，结果显示，最佳浓度为0.30 mmol/L。
4.反应曲线的研究：在试管中加入试剂1即酶混合液1 000 μl，高值质控血清(2.2 mmol/L)20 μl；再加试剂2即色原剂溶液50 μl，吸入半自动生化分析仪中，每30秒读取A值，结果见图1。10分钟后吸光度不再增加，标本终点法选择读数时间600秒是合适的。呈色后的标本分别于30分、40分、60分测定吸光度，其A值均无明显变化。
5.本法的线性：配制6 mmol/L的磷标准液，按不同比例稀释成为含磷0.3、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L的系列标准液，用本法在全自动分析仪上测定，显示磷在0.25～5.00 mmol/L范围内线性甚好。
图1 显色反应时间对吸光度的影响 6.精密度：以宝灵曼定值质控血清(高值为1.73 mmol/L，低值为0.66 mmol/L)作为标本，重复测定20次，高值血清的变异系数(CV)为1.30%，低值血清的CV为1.04%，批间测定为每天上下午双份测定，共10天，所得批间CV为高值3.14%，低值2.44%。 7.回收试验：以宝灵曼定值质控血清(含量为1.73 mmol/L)为基础，分别加入高、中、低三种含量的磷标准液，使最终浓度为2.53、2.13、1.93 mmol/L时进行回收试验，所得回收率分别为102.2%、103.6%和104.4%。 8.方法比较：选择不同磷含量的标本40份，同时用本法(Y)和中生公司紫外分光光度法试剂盒(X)测定，结果见图2，两者的相关系数r=0.998，Y=1.056X-0.052。 图2 POD比色法与紫外分光光度法的比较 9.干扰试验：选择一份含量为1.70 mmol/L的标本，分别加不同量的血红蛋白、胆红素、及甘油三酯(TG)标准液，在Abbot EPX全自动生化分析仪上以标本空白终点式进行测定。由于每份标本在测定时均减去标本空白管，故以±5%以内作为无明显干扰。可见当血红蛋白＜2 g/L，胆红素＜300 μmmol/L，和脂浊相当于TG＜3.0 mmol/L时均无明显干扰。 10.参考值：选择健康体检者的血清40份，用本法测定无机磷的含量，结果(±s)为1.212±0.240 mmol/L。 讨论
1.血清无机磷的测定，无论从最早的使用还原剂还原磷钼酸为钼蓝比色，还是到直接测定非还原磷钼酸复合物在340 nm的吸光度值，都会遇到磷酸盐阴离子在此酸性反应环境中反应不完全，用340 nm波长测定时，需要紫外分光光度计，溶血和脂血影响空白等主要问题［1］。酶法测定无机磷是发展方向，其优点是无机磷酸盐化合物在酶发生作用的中性范围内是稳定的。较早提出的一种酶学测定方法是采用糖原磷酸化酶、磷酸葡萄糖变位酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的偶联系统，由NADP的形成来测定磷酸盐的总量［2］。缺点是所用工具酶较多，内源性葡萄糖影响很大，并要使用紫外法测定。本法用PNP偶联黄嘌呤氧化酶，生成的过氧化氢用临床化学中最常用的Trinder反应呈色，在可见光范围内测定，标本用量少，结果稳定，操作简便，适用于手工、半自动、全自动测定。
2.Trinder反应由于试剂无毒、产物为红色易于测定而被广泛使用。研究使用新色原可以提高敏感度。常见的色原有苯酚、2，4二氯苯酚、3-甲基-氨基苯甲酸、3，5-二氯-2-羟基苯磺酸等。本法所用的色原为2，4，6-三溴-3-羟基苯甲酸(TBHBA)，由本室合成，灵敏度比其他几种色原高3～10倍，已成功应用于葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、尿酸［3］。
参考文献
1林其燧，文庆成译.临床化学诊断方法大全.北京：北京大学出版社，1990.869-874.
2Gawehn K. The determination of Inorganic phosphate, Methods of Enzymatic Analysis, 3rd Ed, Verlagchemie: Weinheim Basel, 1985.552-555.
3崔云龙，李玲，嵇志珍，等.新色原(TBHBA)在测定血清尿酸中的应用及其与其他色原的比较.陕西医学检验杂志，1992，7：193-194.