摘要】 目的 研究脂蛋白(a)［Lp(a)］、血小板(PLT)及其蛋白激酶C(PKC)在血栓性疾病中的变化及其作用。方法 心肌梗塞、脑梗塞和健康对照组各24例，分别检测血清Lp(a)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)、载脂蛋白AI(apoAI)、载脂蛋白B(apoB)、血小板(PLT)及其膜和浆蛋白激酶C(M-PKC和P-PKC)，对检测结果做统计学分析。结果 心梗组和脑梗组Lp(a)、TG、apoB均明显增高，HDL-C则明显降低，与健康对照组的差异有非常显著性或显著性意义；PLT计数和M-PKC活性增高、P-PKC活性减低，与健康对照组相比，在心梗组呈差异有非常显著(P＜0.01)，在脑梗塞组差异有意义(P＜0.05)。结论 心肌梗塞和脑梗塞时除TG和apoB增高，HDL-C减低外，Lp(a)、PLT及M-PKC增高(P-PKC减低)，在血栓早(前)期起重要作用，对心梗和脑梗的发病起促进作用。
The changes of Lp(a), PLT, PKC in cardiac and cerebral infarction Zhang Lixia, Gao Sanyang, Wang Xuerong, Kang Hui, Yu Bingzhi First Clinical College, China Medical University, Shenyang 110001
【Abstract】 Objective The change and function of Lp(a), PLT, PKC were studied in thrombolic diseases. Methods Objects examined were composed of 3 groups: Cardiac infarction, cerebral infarction and healthy controls (24 cases in each group). Lp(a), TC, hDL-C, LDL-C, TG, apoA, apoB, PLT, M-PKC P-PKC of three groups were tested and the results were done with statistic analysis. Results Lp(a), TG, apoB of patients increased and HDL-C decreased significantly. PLT and M-PKC activity increased and P-PKC activity decreased significantly (P＜0.01, P＜0.05). Conclusion Lp(a), PLT, and M-PKC of patients increased (P-PKC decreased). They weren′t only the pathologic basis of arthrosclerosis, but the important factors in prethrombosis. So they promoted the occurrence of cardiac and cerebral infarction.
【Key words】 Cardiac infarction Cerebral infarction Lipoprotein(a) Platelet Protein kinase C
心肌梗塞和脑梗塞常与动脉粥样硬化(AS)有密切关系，而栓塞又常为其重要的病理基础。在血栓形成中，血小板(platelet, pLT)起重要的作用，PLT中的蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)与PLT的结构和功能密切相关，是PLT活化的标志。关于AS的发病机理有关于脂质代谢紊乱学说，特别是近年来研究认为与高脂蛋白(a)［Lp(a)］血症有关。但在AS和血栓性疾病中Lp(a)与PLT中PKC的关系，尚未见报道，我们对上述问题进行了研究和探讨。
材料与方法
材料与方法
一、实验对象
心肌梗塞病人(下称心梗)和脑梗塞病人(下称脑梗)各24例，分别为中国医科大学附属一院、沈阳中心医院循环内科、鞍山市铁东医院神经内科住院病人。心梗诊断按1979年WHO关于心肌梗塞诊断标准，脑梗诊断按1981年NINCDS及1990年WHO关于脑梗塞诊断标准。正常对照组24例，为无心、脑血管疾病的健康志愿者及献血员。全部空腹12～16小时静脉采血(表1)。
二、仪器和试剂
1.仪器：(1)高速离心机(美国，杜邦OTD-55B)。
表1 实验分组及有关情况(n=24)
| 组别 |
性别组成 |
年龄组成 |
| 男性 |
女性 |
平均年龄 |
年龄范围 |
| 心肌梗塞组 |
11 |
13 |
59 |
48～78 |
| 脑梗塞组 |
20 |
4 |
58 |
33～70 |
| 正常对照组 |
21 |
3 |
45 |
32～55 |
(2)全自动生化分析仪(日本、HITACHI 7150)。(3)全自动血细胞分析仪(美国，ABBOT CD1600)。(4)液闪测定仪(美国，BACKMAN LS-1 801)。 2.试剂：(1)DEAE为Pharmacia产品。(2)磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、组蛋白Ⅲs(HⅢs)、ATP均购自美国Sigma公司。(3)r-32P-ATP，为亚辉生物医学公司提供。(4)Lp(a)试剂盒，由卫生部老年病研究所提供。(5)其它血脂试剂盒，均由上海长征医学公司提供。 三、方法 1.Lp(a)为单克隆抗体的双位点双抗夹心ELISA法测定，总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、载脂蛋白AI和B(apoAI、apoB)为双试剂免疫比浊法，由HITACH I7150自动生化分析仪测定。 2.PLT及其参数，即平均血小板体积(MPV)、血小板压积(PCT)、血小板分布宽度(PDW)，均由美国雅培公司CD 1600血细胞自动分析仪测定。 3.PKC测定方法：(1)标本采集：晨空腹安静状态采取静脉血10 ml，加到含有1.2 ml 50 mmol/L EDTANa2的抗凝管中，混匀，立即测定PLT及其参数后，马上置入冰水浴中，低温分离PLT和血浆。分离的PLT经BufferA(含2 mmol/L EDTA，10 mmol/L EGTA，20 mmol/L Tris-HCl，pH7.5，0.25 mmol/L蔗糖)洗涤后置4℃备用。血浆置-20℃保存，备测血脂项目。(2)PLT胞浆胞膜分离：PLT以BufferA 2 ml旋起后，超声粉碎60秒，高速低温离心(10 000×g，1小时)分离上清为胞浆，置4℃备用；沉淀以1% TritonX-100 2.0 ml旋起，超声助溶，过夜提取膜蛋白，再高速低温离心(10 000×g，1小时)分离膜脂，上清为膜蛋白，置4℃备用。(3)PKC活性测定：以PLT胞浆、胞膜为样本，取10 μl加入到总体积为50 μl的反应管中(含20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，2 mmol/L Mg(AC)、0.5 mmol/L CaCl2，40 mg/L Ps、0.8 mg/L DG，10 mmol/L cold ATP，0.2 g/L HⅢs，r-32P-ATP总放为20万左右CPM)，恒温水浴振荡(1次/s)，30℃，7分钟，即刻转移至阳离子吸附树脂膜，以磷酸盐缓冲液终止反应，并洗脱非结合同位素，烘干，转入10 ml液闪瓶中，液闪仪测定6次CPM数，取均值
1.血清Lp(a)与其它血脂项目测定结果见表2。
2.PLT及其参数测定结果见表3。
表2 血清Lp(a)与其它血脂 测定结果(n=24，mmol/L，△为mg/L)
| 组别 |
心梗组 |
脑梗组 |
对照组 |
| Lp(a)△ |
|
298.3** |
332.7** |
154.0 |
| s |
261.7 |
269.8 |
83.0 |
| HDL-C |
|
0.63* |
0.59** |
0.84 |
| s |
0.28 |
0.24 |
0.26 |
| LDL-C |
|
2.03 |
2.47 |
2.11 |
| s |
0.62 |
0.81 |
0.71 |
| TG |
|
1.09** |
1.14** |
0.62 |
| s |
0.63 |
0.54 |
0.29 |
| TC |
|
3.39 |
3.87 |
3.43 |
| s |
0.72 |
0.92 |
0.78 |
| apoAI△ |
|
1.26 |
127 |
1.29 |
| s |
0.09 |
0.09 |
0.07 |
| apoB△ |
|
0.58* |
0.63** |
0.53 |
| s |
0.07 |
0.07 |
0.07 |
注：** P＜0.01；* P＜0.05 表3 PLT及其参数测定结果(n=24)
| 组别 |
心梗组 |
脑梗组 |
对照组 |
| PLT(×109/L) |
|
300.4** |
301.4* |
228.8 |
| s |
87.6 |
124.1 |
89.1 |
| MPV(FL) |
|
8.50 |
9.30 |
9.23 |
| s |
0.91 |
1.33 |
1.49 |
| PCT |
|
2.58 |
2.75 |
2.17 |
| s |
0.26 |
1.09 |
1.11 |
| PDW(%) |
|
17.65 |
17.37 |
17.64 |
| s |
1.07 |
0.84 |
0.83 |
注：** P＜0.01；* P＜0.05 3.PKC测定结果：PLT胞膜和胞浆分别测PKC，即膜PKC(M-PKC)和浆PKC(P-PKC)。结果表4。 表4 M-PKC和P-PKC测定结果(x±s pmol/mg.min)
| 组别 |
心梗组 |
脑梗组 |
对照组 |
| M-PKC |
294.57±82.82** |
272.04±58.21* |
235.41±62.22 |
| P-PKC |
92.59±26.40** |
95.48±27.31* |
112.10±22.65 |
注：** P＜0.01，* P＜0.05,n=24 讨论
Lp(a)在AS成因中被视为独立的危险因子，是AS斑块中重要的脂质成分。有文献报道Lp(a)可与PLT结合，但结合后对PLT活化有何影响却是个迷。Lp(a)与纤溶酶原(plasminogen, PNG)结构相似，能竞争性地抑制PNG与PLT结合，从而抑制纤溶过程，抑制血栓溶解。血栓形成与纤溶可视为矛盾的两个方面，既然Lp(a)可以与PLT结合，又可抑制纤溶过程及血栓溶解，Lp(a)对PLT的活化也应该起促进作用，从而促进血栓的形成和栓塞的病理过程。PKC是PLT活化的标志，PKC活性增高反映了PLT被活化。如果Lp(a)与PLT结合后PKC活性增高，就说明Lp(a)可促进PLT活化，从而促进血栓形成。血小板血栓是早期血栓，因而Lp(a)和PKC在血栓早期(甚而血栓前期)中起促进作用。我们通过临床流行病学研究，揭示了Lp(a)、PLT和PKC在血栓早期(或前期)的作用。
表2结果表明：心梗和脑梗时血清Lp(a)、TG和apoB均明显升高，尤其Lp(a)水平升高更为明显，与健康对照组间差异有非常显著意义(P＜0.01)；HDL-C则明显减低；TC与apoAI未见明显变化。上述血脂检测结果表明，在心梗和脑梗(AS及血栓性疾病)时，确定存在高Lp(a)血症，本研究疾病组血清Lp(a)浓度升高至正常时的2倍。如此高浓度的Lp(a)可以更多的结合PLT，并促进其活化，促进血栓形成。
表3结果表明：心梗和脑梗时PLT总数明显增多，以心梗时PLT增多更为明显，与健康对照组的差异分别有非常显著及显著意义(P＜0.01及P＜0.05)；而MPV、PCT、PDW等三项血小板参数未见变化。说明在心梗和脑梗时，高浓度的Lp(a)可能与数量增多的PLT相结合，能促进AS和梗塞的发生和进展。
表4结果显示：心梗和脑梗时PLT膜PKC(M-PKC)活性增高，PLT浆PKC(P-PKC)活性减低；但M-PKC增高大于P-PKC减低。正常时(对照组)M-PKC/P-PKC比值约为2/1(235.41/112.10)，而心梗和脑梗时M-PKC/P-PKC约为3/1(294.57/92.57及272.04/95.48)。分析上述变化的原因：(1)P-PKC从PLT浆移向PLT膜，即PLT浆中PKC向PLT膜翻转(transl-ocation)。(2)PLT膜固有的M-PKC活性亦增高，而且表4数据表明(2)＞(1)。M-PKC活性的增高，更有利于PLT的粘附，聚集和释放等生物活性作用的发挥，从而促进早期血栓的形成及促进血凝。