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(PENG Xiaomou, GAO Zhiliang, CHEN Xuejuan, et al.

Viral Hepatitis Research Department of the 3rd Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510630)

【Abstract】 Objective To investigate the significance of the new DNA virus (TTV) infection in persons with elevated alanine aminotransferase (ALT) during routine medical check up and patients with liver diseases, and analyze its pathogenesis.Methods PCR was used in the detection of TTV DNA in 19 serum samples from ALT elevated persons and 41 from ALT normal persons during their routine medical check up, and 182 serum samples from patients with various kinds of liver diseases. PCR products were confirmed by RFLP. Other hepatitis viruses were simultaneously detected using routine methods.Results TTV DNA was detected in 10.53%(2/19) and 2.44%(1/41) in groups of ALT elevated and control respectively with no significant difference between their detective rates (P＞0.05). There were 9 cases with current HBV infection, 1 case with hepatitis C and 1 case with hepatitis A in group of elevated ALT. Two TTV positive cases were both superinfected with HBV. The detecting rate of TTV DNA in patients with liver diseases was 4.4%. Only one case out of 18 non A to G hepatitis showed TTV DNA in serum.Conclusion There were TTV infections in Chinese population. The main cause for ALT elevation in persons during routine medical check up was HBV infection. There were TTV infections in patients with liver diseases too. However, TTV wasn′t the main cause of non A to G hepatitis. Thus, the pathogenesis of TTV might be very weak. 【Key words】 Viral hepatitis Alanine aminotransferase TT virus Etiology Pathogenesis 自从庚型肝炎病毒(HGV)被发现以来，目前肝炎病毒已增加到了6种。然而，仍有约10%肝炎患者肝炎病毒血清标志表现为全部阴性，即所谓的非甲～庚型肝炎(Non A to G hepatitis, NA-G)^［1～4］。近来日本学者采用差式文库的分子生物学方法从1例输血后NA-G肝炎患者血清中分离出500 bp的DNA片段。并根据患者命名为TT病毒(TTV)，这种病毒似乎能引起谷丙转氨酶(ALT)轻度升高^［5，6］。在ALT升高的体检人群中也能检出TTV DNA^［7］。我们进一步采用对照形式分析TTV在ALT升高的体检人群和肝病患者中的意义，进而探讨其致病性。 1 材料和方法 1.1 病例 19例ALT升高者(＞70U/L)和41名随机抽出作对照的ALT正常人筛自1998年4月广东省玻璃厂的660名健康体检者。182例肝病患者为本院传染病科1998年5～8月的住院病人。 1.2 方法

1.2.1 PCR检测TTV DNA 血清中TTV DNA检测采用常规热变性法制备裂解上清，以5′-GCAGCAGCATATGGATATGT-3′(TTV1，正义)和5′-TGACTGTGCTAAAGCCTCTA-3′(TTV2，反义)为外引物进行第一次扩增，产物为270 bp。第一次产物再以5′-CATACACATGAATGCCAGGC-3′(TTV3，正义)和5′-GTACTTCTTGCTGGTGAAAT-3′(TTV4，反义)为内引物进行第2次扩增，产物为197 bp。用2%琼脂糖凝胶电泳分析结果。 1.2.2 PCR产物的限制性片段长度多态性(RFLP)分析 197 bp的聚合酶链反应(PCR)产物中存在一个限制性内切酶KpnⅠ的位点。消化的片段分别为169 bp和28 bp。50 μlPCR产物凝胶过滤去除剩余引物，常规采用氯仿抽提和乙醇沉淀后，沉淀物溶于9 μl双蒸水中，加1 μl10×缓冲液，2UKpnⅠ，于37℃消化1小时，以2%琼脂糖凝胶电泳分析结果。 1.2.3 其他肝炎病毒血清标志检测 抗-HAV和抗-HGV采用中山生物工程公司试剂进行检测，血清HBV标志和抗-HCV采用美国Abbott试剂进行检测，抗-HEV采用新加坡Genelabs公司试剂进行检测。 1.2.4 统计学方法 采用χ²检验或Fisher精确概率计算。 2 结果 2.1 血清中TTV DNA 巢式PCR检测ALT升高标本中TTV DNA的结果和RFLP分析结果见图1。阳性产物的碱基数与设计相符。所有阳性PCR产物经限制性内切酶消化后所提DNA片段与期望大小一致。 图1 PCR检测血清中TTV DNA的产物分析

1：KpnⅠ酶切；2：未酶切对照；3：100 bp ladder(GIBCO BRL, USA);4，6：阳性标本；5：阴性标本

Fig.1 PCR products of serum TTV DNA

Lane 1:Digested with KpnⅠ. Lane 2:Undigested control. Lane 3: 100 bp ladder from GIBCO BRL, USA. Lane 4,6:Positive Samples. Lane 5:Negative sample.

2.2 健康体检人群中ALT升高与TTV和肝炎病毒感染的关系 60份血清标本中TTV DNA和其他病毒感染标志检测结果见表1。19例ALT升高者中，根据病毒性肝炎防治方案(1995)，诊断为乙型肝炎9例，甲型和丙型肝炎各1例，原因不明8例。2例TTV DNA阳性者均为HBsAg阳性。 表1 血清中TTV DNA和其他病毒感染标志检测结果

Tab.1 Detection of TTV DNA and serum markers of other viruses

*χ²检验或Fisher精确概率计算

*Chi-square or Fisher exact possibility test

2.3 肝病患者中TTV DNA的检出情况 182例肝病患者中，TTV DNA检出情况，以及与肝病临床类型和病原学类型的关系见表2。肝病患者中TTV DNA的总检出率为4.4%。TTV DNA在各临床类型和病原学类型间的检出率差异均无显著性(P＞0.05)。 表2 肝病患者中TTV DNA的检出情况

Tab.2 Detection of TTV DNA in patients with hepatitis or liver cirrhosis

2.4 TTV DNA阳性者其它病毒混合感染情况 60名体检者和182例肝病患者中，共检出TTV dNA阳性者11例，年龄为23～55岁，平均38.3岁；男8例，女3例。其中5例有输血史，10例伴ALT升高。10例ALT升高者中，重叠HBV感染者8例，重叠HCV感染者1例，仅1例为NA-G肝炎。该患者男性，32岁，体检发现ALT升高2个月入院，ALT为42U/L～142U/L，无黄疸，无输血及血浆史，无饮酒嗜好，无服用肝损药物史，无血吸虫疫水接触史，血脂正常，大便中未发现肝吸虫卵。3 讨论

日本学者Nishizawa等采用差式文库方法从输血后Non-A to G肝炎患者的血清中分离出病毒克隆N22，并证实其来源于DNA病毒的基因组，因而根据患者命名为TTV。目前已在献血员和血液制品，以及原因不明输血后肝炎患者中检出该病毒^{［5，6，8］}。5例输血后NA-G肝炎患者中，3例为阳性，且TTV DNA水平与血清转氨酶的水平相关。平均于输血后6-8周开始检出，持续约5～8周，其中1例6周开始检出，观察至21周时仍为阳性，但DNA水平已开始下降^［5］。在中国ALT升高的体检者中也能检出

TT病毒^［7］。然而，TTV的确切致病性目前尚不十分清楚。

本研究在本组健康体检人群中能检出一定水平的TTV感染。其中ALT升高者中检出比率为10.53%，ALT正常者中检出比率为2.44%。两者差异无显著意义(P＞0.05)。结合其他肝炎病毒感染情况分析显示，HVB感染是健康体检人群中ALT升高的主要原因。HCV和HAV感染也有一定作用。TTV DNA在ALT升高和正常人群均能检出，检出率两者差异无显著意义，且2例TTV DNA阳性的ALT升高者均重叠HBV现症感染，提示TTV感染在ALT升高体检者中的意义不大。在急性、慢性肝炎和肝硬变患者中也能检出一定水平的TTV感染(4.4%)。但各临床类型和病原学类型之间差异无显著意义。在8例TTV DNA阳性患者中绝大部分(7例)合并具有肯定致病性的肝炎病毒现行感染。仅个别NA-G肝炎患者为TTV DNA阳性(1/18)。提示TTV不是原因不明肝炎的主要病因。

我们认为，TTV感染在ALT升高的体检者中的意义不大，也不是NA-G肝炎的主要病原体，因而，TTV的致病性可能相对较弱或TTV不是一种重要的肝炎病毒。

本课题受广东省自然科学基金(编号：970079)和中山医科大学“211工程”专项基金资助

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