激光扫描共焦显微镜（LSCM）

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激光扫描共焦显微镜（LSCM）
发布时间 2007/4/5 点击 4203 次

激光扫描共焦显微镜（LSCM）

激光扫描共焦显微镜（LSCM）是八十年代问世的一种新型分析仪器，由于其高分辨率，高灵敏度，高放大率等特点，在细胞水平上能作多种功能测量和分析，成为分析细胞学的重要研究工具，激光扫描共焦显微镜是在显微镜基础上配置激光光源，扫描装置，共轭聚焦装置和检测系统而形成的新型显微镜。它对活细胞分层扫描后得到光学切片，可进行细胞三维重建。测量分析细胞形态学参数和荧光强度。利用荧光探针标记LSCM可以对细胞内微细结构和离子的动态变化进行定性、定量、定时和定位分析。LSCM可以进行显微手术，细胞分选，细胞胞间通讯和膜的流动性等测量。它的应用前景非常广泛，将为生物医学和生命科学领域的科研工作提供新的手段。
细胞的三维重建（3-D Reconstruction）

　　普通荧光显微镜分辨率低，显示的图象结构为多层面的图象迭加，结构不够清晰。LSCM能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，经A／D转换后作为二维数组贮存。这些数组通过计算机进行不同的三维重建算法，可作单色图象处理，双色图象处理，组合成细胞真实的三维结构。旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可不同的断面观察细胞内部结构，测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。通过模拟荧光处理算法，可以产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感。通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。LSCM的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析，染色体分析，细胞程序化死亡的观察，细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。

细胞定量荧光测定

　　显微荧光光度计由于显微镜和激发光源的限制成象模糊，只能测定细胞内的荧光总量，有一定的误差。LSCM以激光为光源，对细胞分层扫描，单独测定，经积分后能得到细胞荧光的准确定量，重复性极佳。它适于活细胞的定量分析，可测定细胞内溶酶体、线粒体、DNA含量、RNA含量、酶和结构性蛋白质等物质含量和分布，常用于原位分子杂交，肿瘤细胞识别，单个活细胞水平的DNA损伤及修复的定量分析。它适于快速高灵敏度测量，减少光粹灭的影响，在定量免疫荧光测定方面应用广泛，如作各种肿瘤组织切片抗原表达的定量分析，监测肿瘤相关抗原表达的定位定量信息，监测药物对肌体免疫功能的作用，监测自身免疫性疾病的多种抗原及药物对肌体免疫功能的作用，监测细胞结合和杀伤的形态特征并作定量分析等。细胞定量荧光测定可选用单荧光。双荧光和三荧光方式，能自动测定细胞面积，平均荧光强度，积分荧光强度及形状因子等多种参数。

　　 细胞内钙离子PH值和其它离子的动态分析

　　通过Indo－1、Fluo－2、Fluo－3、Calcium green、SNARF等多种荧光探针，可对细胞内钙离子、钠离子及PH值等作荧光标记并对它们进行比率值和浓度梯度变化测定。由于细胞内钙离子为传递信息的第二信使，对细胞生长分化起着重要作用，通过单标记或双标记对细胞内钙离子和其它离子的荧光强度和分布精确测定，测定样品达到毫秒级的快速变化。借助光学切片功能可以测量样品深层的荧光分布以及细胞光学切片的生物化学特性的变化。通过不同时间段的检测可测定细胞内离子的扩散速率，了解它对肿瘤启动因子、生长因子等刺激的反应。细胞内离子测量广泛用于肿瘤研究、组织胚胎学、细胞生物学和药理学等领域。

　　细胞胞间通讯（Cell Communication）和膜的流动性

　　动物和植物细胞中缝隙连接介导的胞间通讯在细胞增殖和分化中起着重要作用。通过测量细胞缝隙连接分子的转移，可以研究肿瘤启动因子和生长因子对缝隙连接介导的胞间通讯的抑制作用及细胞内钙离子、pH值等对缝隙连接作用的影响，并监测环境毒素和药物在细胞增殖和分化中所起到的作用。选定经荧光染色后的细胞，借助于光漂白作用或光损伤作用使细胞部分或整体不发荧光，实时观察检测荧光的恢复过程，可直接反应细胞胞间通讯结果。

　　细胞膜的流动性在进行膜的磷脂酸组成分析，药物作用点和药物作用效应，测定温度反应和物种比较方面有重要作用。细胞膜荧光探针受到极化光线激发后，发射光极性依赖于荧光分子的旋转，这种有序的运动自由度取决于荧光分子周围的膜流动性，所以极性测量能间接反映细胞膜的流动性。

　　荧光光漂白恢复（Fluorescence Redistribution After Photo bleaching，FRAP）

　　FRAP是用来测定活细胞的动力学参数，借助于高强度脉冲激光来照射细胞某一区域，造成该区域荧光分子的光粹灭，该区域周围的非粹灭荧光分子会以一定的速率向受照射区域扩散，这个扩散速率可通过低强度激光扫描探测,因而可得到活细胞的动力学参数。LSCM可以控制光粹灭作用，实时监测分子扩散率和恢复速率，反映细胞结构和活动机制。广泛用于研究细胞骨架构成，核膜结构跨膜大分子迁移率，细胞间通讯等领域。

　　笼锁-解笼锁测定（Caged-Uncaged）

　　这是一种光活化测定功能。生物活性产物或其它化合物处于笼锁状态时，其功能封闭，一旦被特异波长的瞬间光照射后，产生光活化解笼锁，恢复原有的活性和功能，在细胞增殖分化等生物代谢过程中发挥功能。LSCM可以控制笼锁探针的瞬间光分，选取特定的照射时间和波长，从而达到人为控制多种活性产物和其它化合物在生物代谢中发挥功能的时间和空间作用。它们包括第二信使、核甘酸、神经介质、钙离子。

　　粘附细胞分选（Adhered Cell Sort）和显微手术（Micro-operation）

　　采用台扫描方式的LSCM，由于激光束固定在显微镜的光轴上，可对载物台上的样品作精确地定位扫描，从而对所要选择的细胞进行分选，Meridian公司的LSCM能够理想地进行这项工作，在不改变细胞培养周围环境，细胞铺展程度和生长状态情况下进行细胞分选。分选方法有两种，一种是光刀切割法（Cookie－Cutter），将细胞贴壁培养在特制培养皿上，利用高能激光在所选细胞周围作八角形切割，只在其间保留所选细胞，选择条件取决于特定荧光和细胞形态学参数，这种分选方法特别适用于选择数量较少的细胞，如突变细胞、转移细胞和杂交瘤细胞等。第二种方法是激光消除法（Laser Ablation），用高能量激光自动杀灭不需要的细胞，留下完整的活细胞亚群继续培养，这种方式取决于细胞荧光特性，特别适于对数量较多的细胞选择。

　　通过这两种方式可以总体扫描细胞群，进行细胞物理和生化特性的选择。能对百万分之一机率发生突变的细胞作筛选，能不改变细胞类型、形态和活性而克隆细胞，能分离细胞亚群并进行定量荧光检测，能存储细胞位置对特定细胞重复测定。这种细胞分选方式效率和精确度都很高。

　　借助LSCM我们可以把激光作为光子刀应用，来完成细胞膜瞬间打孔，线粒体、溶酶体和染色体的切割，以及神经元突起切割等显微细胞外科手术。

　　激光光陷阱技术（Optical trap）

　　激光光陷阱技术又称为光摄技术，就是利用光学梯度力形成的光陷阱，产生具有传统机械镊子挟持和操纵微小物体的功能。当微米级范围的颗粒落人一个非均匀光场中，它将趋于特定的平衡位置，如果没有外界强有力的干扰，物体不会偏离光学中心。由于外界作用和粒子自身运动等原因产生的中心偏离也会很快恢复原位，光造成一个势能较低的陷阱区域，当物体的动能不能克服周围势垒时，它将留在陷阱内。这种固定是光子动量的结果，与照明强度和波长直接有关。较大物体比较小的结构需要更多的陷阱能量。光摄可以在保持处在生产环境中的细胞仍可与外界沟通的条件下，对目标细胞进行非接触式的捕获与固定，井进行精确地操作，克服了以往单细胞操作中细胞难以固定和易产生机械损伤的弱点。这项新技术广泛应用于染色体移动，细胞器移动，细胞骨架弹性测量，细胞周期和调控研究及分子动力原研究等方面，尤其是在探测植物细胞骨架时，光陷阱是目前能探测其弹性和流变性的唯一技术。
[来源：来宝网]

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