典型的PCR操作
(一) 试剂
(1)引物根据待扩增DNA不同，引物亦不同。
(2)耐热DNA聚合酶：此酶是从耐热细菌中分离出来的，能耐受高温(93—100℃)。
(3)10x PCR缓冲液： 500mm01／L KCl； 100mmol／L Tris一HCl(pH8.4， 20℃)，150mmol／L MgCl2， lmg／m1明胶。
(4)5mmo1／L dNTP贮备液：将dATP，dCTP，dGTPT和dTTP钠盐各100mg合并，加3m1灭菌去离子水溶解，用NaoH调pH至中性，分装每份300v1， (-) 20℃保存dNTP浓度最好用uv吸收法精确测定。另外。现在已有中性dNTP溶液商品供应(Sigma公司和Pharmacia公司等).
(5)标本处理试剂：不同标本所需试剂不同，根据具体情况而定.
(二) 操作程序
利用PcR扩增的操作程序基本相同，只是根据引物与靶序列的不同，选择不同的反应体系与循环参数(见本章第：：节)o基本的操作是将PcR必需反应成分加入一微量离心管中，然后置于一定的循环参数条件下进行循环扩增。每个实验室或每个人都有不同的操作习惯，但需遵守一定的操作规范。
我们推荐下述操作程序，因这样操作可最大程度地增加反应的成功率。
(1)向一微量离心管中依次加入：
ddH20 补至终体积(终体积50~100ul)
10 x PCR缓冲液 1／10体积
dNTP 各200umol／L
引物 各1umol／L
DNA模板 10*10一10*10*10*10*10拷贝
混匀后，离心15s使反应成分集于管底。
(2)加石蜡油50—100ul于反应液表面以防蒸发。置反应管于97c变性7min(染色体DNA)或5min(质粒DNA).
(3)冷至延伸温度时，加入1—5U Taq DNA聚合酶，在此温度作用1min.
(4)于变性温度下使模板DNA变性适当时间。
(5)在复性温度下使引物与模板杂交一定时间。
(6)在延伸温度下使复性的引物延伸合适的时间。
(7)重复(4)一(6)步25—30次。每次即为一个PcR循环o
(8)微量琼脂德凝胶电泳检查扩增产物(见本章第7节)o
上述过程可以用PcR自动热循环仪进行，也可以设定3个恒温水浴锅手工操作.
第二节 PCR条件的优化
PCR必需具备下述基本条件：①模板核酸(DNA或RNA)；②人工会成的寡核苷酸引物；②合适的缓冲体系；①Mg2+；⑤三磷酸脱氧核苷酸；⑥耐热DNA聚合酶；⑦温度循环参数(变性、复性和延伸的温度与时间以及循环数)o另外，还有一些其它因素，如二甲基亚砜、甘油、石蜡油、明胶或小牛血清白蛋白等也影响某些特定PCR。下面分别讨论这些因素在PCR反应中的作用及其对PCR的影响。
一、模扳核酸
PcR可以以DNA或RNA为模板进行核酸的体外扩增。不过RNA的扩增需首先逆转录成cDNA后才能进行正常PCR循环。核酸标本来源广6t可以从纯培养的细胞或微生物中提取，也可以从临床标本(血、尿、粪便、体腔积液、嗽口水等)、犯罪现场标本(血班、毛发、精斑等)和病理解剖标本(新鲜的或经甲醛固定石蜡包埋组织)以及考古标本中直接提取。无论标本来源如何，待扩增核酸都需部分纯化使核酸标本中不合DNA聚合酶抑制剂。
PcR反应中模板加入量一般为10*10一l0*10*10*10*10拷贝的靶序列。1ug人基因组DNA相当于3xl0*10*10*10*10个单拷贝的靶分子；10ng酵母DNA相当1：3xl0*10*10*10*10靶分子，1ng大肠杆菌DNA相当于3xl0*10*10*10*10靶分子；1％的M13噬菌斑相当于
10*l0*10*10*10*10靶分子。因此，扩增不同拷贝数的靶序列时，加入的合靶序列的DNA量亦
不同。如真核rRNA基因有200—500拷贝，反应中仅需加入0.5—2ng人基因组DNA即可。
以质粒DNA或染色体DNA为模板时的扩增最适条件是不同的。前者所需的酶量少，循环数夕，温度不如染色体DNA要求严格。扩增染色体DNA时至少需25—30循环，如在第15循环后补加一些Taq酶会获得更好的扩增效果。
扩增靶序列的长度根据不同目的而不同。用于检测目的的扩增片段长度一般为500bp以内，以100一300bp为最好。用Taq DNA聚合酶在合适条件(较长延伸时间)下，可扩增长达10一20kb的片段。
二、引物
PCR扩增产物的大小是山特异引物限定的。因此，引物的设计与合成对PCR的成功与否有着决定性的意义。
(一) 引物合成的质量
合成的引物必须经聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向高压液相层析(HPLC)纯化。因为合成的引物中会有相当数量的“错误序列”，其中包括不完整的序列和脱膘吟产物以及可检测到的碱基修饰的完整链和高分子量产物。这些序列可导致非特异扩增和信号强度的降低。因此，PCR所用引物质量要高．且需纯化。冻干引物干—20℃至少保存32—24个月，液体状于-20℃可保存6个月。引物不用时应存—20℃保存。
(二) 引物的设计原则
遵循一些简单的规则有助于没计PcR引物，通过微机的帮助更有利于PCR的成功。关于引物的详细设计原则与方法详见本章第三节。
(三) 引物的用量及其计算
一般PCR反应中引物的终浓度为0．2—1umol／L，在此范围内，PCR产物量基本相同。但引物低于0.2umol／L时，则产物量降低。引物浓度过高会促进引物的错误引导非特异产物合成，还会增加引物二聚体的形成。非特异产物和引物二聚体也是PCR反应的底物，与靶序列竞争DNA聚合酶，dNTP底物，从而使靶序列的扩增量降低。
引物浓度的计算可按下面的方法进行：摩尔淬灭系数（Em)是lcm光程比色杯中测定1mol／L寡核苷酸溶液在UV 260nm下的光密度〔0D)值。Em可按下式计算：
EM＝a(16000)十b〔12000)十c(7000)十d(9600)
其中，a、b、c和d分别代表寡核苷酸中A、G、C和T的个数。
例如， —纯化的20mer寡核苷酸溶于0.1ml水中，取10ul稀释至10mL，测其0D＝0.76。原液的0D为0.76x100=76。若此寡核苷酸碱基组成为A＝5，G＝5，C＝5*T＝5，其EM为：
EM＝5(16000)十5(12000)十5(7000)十5(9600)＝223000
因此，原液个寡核苷酸的摩尔浓度为：
76／223000＝3.4x10-4moI／L=340nmol／L
三、缓冲液
目前最为常用的缓冲体系为10—50mmol／L Tris—HCl(pH8.3—8.8、20c)o Tris是一种双极性离子缓冲液，20℃时其pKa值为8.3，pKa值为-0.021／℃。因此，20mmol/L Tris一HCl(pH8.3, 20℃)在实际PCR中，PH变化于6.8—7．8之间。改变反应液的缓冲能力,如将Tris浓度加大到50mmol／L，pH 8.9，有时会增加产量。反应混合液中50mmol／L以内的KCl有利于引物的退火，50mm01／L NaCl或50mmol／L以上的KCl则抑制Taq DNA聚合酶的活性。有些反应液中以NH4+代K+,其浓度为16.6mmol／L。反应中加入小牛血清白蛋白(100ug／ml或明胶(0.01％)或Tween20(0.05％一0.1％)有助于酶的稳定， 反应中加入5mmol／L的二巯苏醇DTT)也有类似作用，尤其在扩增长片段(此时延仲时间长)比加入这些酶保护剂对PCR反应足有利的。
四、Mg2+，
Mg2+是TaqDNA聚合酶活性所必需的。因此，反应中优化Mg2+浓度是非常有益的。Mg2+浓度除影响酶活性与忠实性外，也影响着引物的退火，模板与PCR产物的解链温度，产物的特异性，引物二聚体的形成等。Mg2+浓度过低时，酶活力显著降低；过高时，则酶催化非特异的扩增。需指出的是，PcR混合物中的DNA模板、引物和dNTP的磷酸基因均可与Mg2+结合，降低Mg2+实际浓度。Taq DNA聚合酶需要的是游离Mg2+。因此，PCR中Mg2+的加入量要比dNTP浓度高0.2—
2.5mmol／L。最好对每种模板，每种引物均进行Mg2+浓度的优化。
另外还需注意引物和模板DNA原液中如含EDTA等螯合剂也会影响游离Mg2+浓度。
优化Mg2+浓度法：首先须知模板DNA量，引物和dNTP浓度和设定的PcR循环参数。反应中的PcR缓冲液中不加Mg2+。Mg2+是从10mmol／LMg2+贮存液中逐一加入反应管中。开始以0．5mmol／L递增(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5—5.0mmol／L)，在确定了Mg2+大概浓度以后，再在该浓度上下，以0.2mmol／L递增和递减几个浓度来精确确定Mg2+的最适浓度。
五、三磷酸脱氧核苷酸（dNTP)
贮备dNTP液应用NaoH调pH至中性，其浓度用分光光度计测定。贮备液为5—10mmol／L，分装后—20℃保存。在PcR的重复热循环过程中共热稳定性应为：50循环后约有50％仍为dNTP。反应小练种dNTP(dATP，dGTP，dTTP和dCTP)的终浓度为20-200umol／L，在此范围内，PCR产物量、特异性与合成忠实性间的平衡最佳。所用的四种dNTP终浓度应相等，以使错误掺入率降至最低。开始发明PcK时，以K1enow片段催化DNA的合成，其dNTP浓度要求1.5mmol／L，而耐热DNA聚合酶的应用使dNTP的使用浓度明显降低，这可减少在非靶位点的错误引导和降低dNTP的错误掺入，从而改善了PCR的特异性与忠实性。最低的适宜dNTP浓度可根据特定靶序列长度和碱基组成来确定。如在100ul反应液中，每种dNTP若为20umol／L，理论上足以合成2．6ugDNA或10pmol的400bp序列。有报道应用每种州20umol／L可成功地捡出10*10*10*10*10*10*10拷贝DNA分子中一个ras点突变。但如此低浓度的dNTP在常规PCR中应避免。因为保持四种dNTP的浓度均在按种dNTPKm值(10-15umol／L)以上，对保持碱基掺入忠实性是很重要的。dNTP终浓度大于50mmol／L时会抑制TaqDNA聚合酶活性。另外，dNTP的类似物也可掺入PCR产物(参考本章第十节）。
六、耐热DNA聚合酶
自从耐热Taq DNA聚合酶引入PCR后， 又有多种耐热DNA聚合酶(VENT和Tth等)相继用于PcR。关于各种耐热DNA聚合酶的性质详见本章第四节，但目前仍以TaqDNA聚合酶应用较多。不同来源聚合酶制备条件、测定方法和(或)单位定义有所不同，使用时需加以注意。下面讨论的酶使用情况是以PE—cetus公司生产的Taq聚合酶为依据的。
在其它参数最佳时，每100ul反应液中含1—2.5U(比活性为20U／pmol)TaqDNA聚合酶为佳。然而，酶的需要量可根据不同的模板分子或引物而变化。当优化PcR时，最好在每100ul反应体积中加入0.5-5U酶的范围内试验最佳酶浓度。如果酶浓度太高，则琼脂糖凝胶电泳中会出现非特异扩增带；过低时，则靶序列产量很低。
PCR后可通过下述方式之一灭活Taq DNA聚合酶：(1)99—100C加热10min(2)加入EDTA Na2至10mmol／L整合Mg2+；(3)酚一氯仿抽提、乙醇沉淀PCR产物。
七、温度循环参数
(一) 变性温度与时间
PCR的变性一步很重要。此步若不能使靶基因模板和(或)PcR产物完全变性，就会导致PCR失败。典型的变性条件是95℃30s，或97℃15s，更高的温度可能更有效，尤其是对富合G十C的靶基因。DNA在其链分离温度(strand separation temperature响酶活性。最简单的方法是在加Taq聚合酶前先使模板在97℃变性7—10min,在以后的循环中，将模板DNA在94℃或95℃变性1min，对PCR的成功亦有益处。环状质粒DNA模板最好酶切线性化，因环状DNA复性极快。在扩增短片段(100一300bp)时，可用简便、快速的两步PcR法，同时在5—10个循环后，将变性温度降至87—90℃可改善PCR产量。具体降低程度则根据共体反应和使用的PCR仪而定。
(二) 复性温度与时间
如果说变性温度对PCR反应的成败是关键，那么复性温度则决定着PcR的特异性。引物复性所需的温度与时间取决于引物的碱基组成、长度和浓度。合适的复性温度应低于扩增引物在PcR条件下真实Tm值的5℃。根据下式计算最适复性温度(Taopt)有助于PCR的成功。
Taopt =0.3Tm1十0.7Tm2-14.9
其中，Tm1为引物的Tm值，Tm2为产物的Tm值。
实际上，由于模板量呈指数增加，PCR每一个循环中的Ta
opt均不同。因此，采用变化的Ta
opt (第一循环为Ta
opt -8℃，以后每隔一循环增加1℃)，对扩增质粒模板中小于1kb的靶片断是有益的
(产量增加，循环数减少)，尤其对300bp以内片段的扩增更为有效。这种变化Taopt法似乎对长片断和染色体DNA的扩增影响不大。但前几个循环在低Ta值下进行，然后再于Taopt下扩增，可增加从染色体DNA中扩增靶序列的量。 对未知序列的扩增很难预知其G十c含量，因此，无法计算上式中的Tm2，不免暴露了上述估算法的缺陷。另一种更简便的方法是通过引物的有效长度(1n)来信算。在此，还需引入另一概念，即有效启动温度(effective priming temperature，Tp)。 Tp是最佳引物介导扩增发生时的最高温度。Tp在一定范围(20一35个核苷酸)内与Ln呈直线相关。
Lp＝22十1.46(1M) (6)
其中Ln＝2(G十C)十(A十T) (7)
最适复性温度为Tp +or-2—5℃。
该法估算的最适复性温度较上法高些。Tp值较引物模板的Tss倪高5-10℃，这是因为引物复性后，DNA聚合酶很快发生聚合反应，在引物3‘端加上数个碱基使引物—模板更稳定，易于在较高温度下发生廷伸。
研究表明，引物的复性是受动力学因素控制的，而不是受热力学参数控制的。它取决于引物解离与延伸效率间的平衡。Tp不仅是PcR的最适复性温度，也是PcR最佳特异性温度，在等位基因特异PCR(As—PCR)时，决定Tp很重要。
Tp值基本上不受Mg2+浓度影响，当Mg2+由15mmol／L升至10mmol／L时，Tp才升高3℃。
确定了复性温度后，复性时间并不是关键因素。但复性时间太长会增加非特异的复性。复性时间也不能太短(＞30s)。如用手控温度反应，从复性状态移至延伸状态的时间不能太长，耽搁过长会增加非特异复性。
(三) 延伸温度与时间
引物延伸温度一般为72℃(较复性温度高10℃左右)。不合适的延伸温度不仅会影响扩增产物的特异性，也会影响其产量。72℃时，核苷酸的掺人率为35—100个核苷酸／s，这取决于缓冲体系、pH、盐浓度和DNA模板的性质。72℃延伸1min对于长达2kb的扩增片段是足够的。然而，延伸时间决定于靶序列的长度与浓度。3—4kb的靶序列需3—4min延伸，延伸时间过长会导致非特异扩增带的出现。
PCR中前几个循环延伸时间应足够长以使靶序列延伸完全，对很低浓度底物的扩增，延伸时间要长些。
(四) 循环数
循坏数决定着扩增程度。在其它参数都已优化条件下，最适循环数取决于靶序列的初始浓度。过多的循环会增加非特异扩增产物的数量和复杂性(见平台效应)。当然，循环数太少，PCR产物就会极低。在初始靶序列为3x105，1.5x104，1x103和50拷贝分子时．其循环数可分别为25—30，30一35，35—40和40一45个循环。
除循环数外，扩增效率也是决定扩增程度的重要因素。实验表明，以染色体DNA为模板时，第25—30个循环过程中，扩增DNA量明显增加。扩增程度(Y)、起始DNA量(A)、扩增效率(R)和循环
数(n)间的关系为：
Y＝A(1十R)n (8)
效率为100％时，25个循环后，Y＝225．A＝33554432A，而效率R＝90％，n＝25时，
Y＝1.925＝9307649A，扩增产物减少72％，由此可见扩增效率对扩增程度的影
八、其它因素
〔一) 高温起动〔hot start)
由于Taq DNA聚合酶在低温下仍具有活性。因此在一般PcR反应的开始加热变性DNA后再加酶的过程中，引物可与模板发生非特异复性，这些非特异复性在达到72℃前就由Taq聚合酶在其3’端聚合上几个碱基并稳定了这种非特异复性引物。因此，可出现非特异延伸和扩增。采用高温起动法便可克服这一缺点，即使Taq聚合酶仅在反应达到较高温度（大于70℃)时才发挥作用。这可通过在高温(70℃)下加入某些必需因子(DNA聚合酶，模板DNA，Mg2+或引物等)来控制。这种方法不仅可增加PcR的特异性，还能增加其敏感性，并可减少引物二聚体的形成和引物的自我复性。这是因为在扩增前加热可促进引物的特异复性与延伸，因此增加了有效引物的长度。
(二) PCR促进刑
1．二甲基亚风(DMSO)：许多耐热DNA聚合酶厂家推荐在PCR反应中加入10％DMSO，这可能是DMSO有变性DNA的作用。DMSO的使用对大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段是有益的，但对Taq DNA聚合酶有抑制作用，
一般反应中应尽量不用DMSO。不过，在复合PCR中可以用。 2．甘油：有报道，反应中加入5％一20％寸油有助于PCR反应的复性过程，尤其对G十C含量高和二级结构多的靶序列以及扩增长片段(大于l 500bp)更适用。应注意的是，DMSO和甘油并非对所有PCR均有益，因此，是否加这些试剂应根据具体情况而定，也需要操作者的探索。
3．氯化四甲基铵（TMAC)： 在反应中加入1x10-4一1x10-5mol／L的TMAC可促进PcR，去除非特异扩增，而不抑制Taq聚合酶。
4．T4噬菌体基因32蛋白质(gp32) ：加入0.5—1ul的gp32(1nmol／L，Pharmacia)可使Taq聚合酶对长片段DNA的扩增改善至少10倍。
(三) 石蜡油
反应中所用石蜡油质量要高，不能含抑制Taq DNA聚合酶活性的杂质。加石蜡油目的是防止反应液蒸发后引起的冷却与反应成分的改变。石蜡油的有无对反应影响较大(表2—2)。但现在PE—Cetus公司又研制了一种新型PCR仪—9600型基因扩增PCR系统免除了加石蜡油的步骤。
石蜡油对PcR产物的影响
石蜡油 产物(Hg) cv
+ 2013 6％
- 405 72％
扩增条件：100uI, 94℃，1min； 37℃, 2min,72℃min, 3min
九、PCR仪
由第一台PCR仪问世以来，已有不同加热—冷却机理的PcR仪相继诞生。不同仪器由于温控精度不同对PCR反应有一定影响，阅此，优化PcR反应时要注意不同仪器间的差别。
十、平台效应(plateau effect)
“平台效应”是描述PCR后期循环产物对数积累的趋于饱和，并伴随0.3—1pmol靶序列的累积。根据反应条件和热循环，下列因素可能与平台效应有关：①dNTP和引物快速掺入底物中，浓度降低；②随产物增加，酶与模板的比例下降；②由于变性温度高(93—95℃)和温度循环，酶活力和dNTP的稳定性逐渐下降；④非特异产物或引物二聚体与反应物的竞争；⑤产物在高浓度时变性不完全，影响引物的延伸；⑧产物浓度高于10
-8mol／L时，可能降低Taq聚合酶的延伸与加工能力(processivity)或引起产物链的分支迁移和引物转换；⑦酶与PCR产物的结合，使酶分子减少。
十一、忠实性
反应中dNTP浓度明显低于Km值(小于1umol／L)或某一dNTP的浓度低于其它三种的浓度时会增加错误掺入。因此，PcR反应中应使用较高浓度的dNTP，且四种dNTP浓度一样。由于Taq DNA聚合酶缺乏3’→5’ 外切酶活性，因此，不能象K1enow聚合酶那样校正错误掺入的碱基，错误掺人有利于链的终止，这是因为酶对错误终端的延伸主要依赖于Km值的差别。研究表明，酶对A—T配对的延伸速率分别比G—T，C—T和T—T错误快200，1400和2500倍。这种链终止限制了缺陷分子的扩增，而有助于保持反应的忠实性。当dNTP浓度过高(大于1mmol／L)时，会促进错配碱基的延伸。在每种dNTP浓度为10一50umol／L时，高温复性与延伸会最大程度地保持反应的忠实性。