连续流动式聚合酶链式反应微流控装置的实验研究
摘要:连续流动式聚合酶链式反应（PCR）微流控装置是以低热容量的软薄膜加热器为基础构建３个恒温带，以聚四氟乙烯毛细管微通道为PCR反应体系组建而成。报道了在毛细管微通道中小牛血清蛋白（BSA）动力学表面钝化对PCR扩增的影响，讨论了PCR混合物在毛细管微通道中的流动速度对PCR扩增的影响，在15 min甚至10 min内成功扩增了长度为249 bp 的人类β肌动蛋白片断，扩增时间仅１０～１５ min,而传统PCR仪则需1～2 h。
关键词:毛细管，连续流动式聚合酶链式反应，微流控装置
1 引言
聚合酶链式反应（PCR）[1]技术已经在生物医学、临床诊断、环境检测等领域得到广泛的应用。传统PCR装置一般通过金属块以及空气或液体循环来控制PCR温度循环，系统通常具有较大的体积和热容，从而导致PCR速度很慢（通常为1～2h）。为了克服传统PCR装置固有的缺点以实现快速的PCR扩增，早在上个世纪90年代初就开展了基于微流体的PCR生物微流控装置研制[2, 3]。目前，PCR生物微流控系统主要有两种形式[4~6]：反应池内固定扩增式PCR和连续流动式PCR。前者实际上是传统PCR的微型化，反应混合物固定在微反应池中，反应池的尺寸常常限制样品的体积，反应时间及其能量消耗主要受系统的热容量所控制，为了取得较快的加热/冷却速度往往需要对系统热容量进行精确的优化。连续流动式PCR的优点主要有：（1）PCR中加热/冷却速度一般不受装置的系统热容量所限制，而是受PCR混合物流动速度控制；（2）样品溶液的蒸发较小；（3）通过连续地提供不同的生物样品来实现同一反应体系中的不同生物样品的连续扩增，大大节省时间和简化操作；（4）PCR混合物的体积可在μL~mL级范围改变；（5）通过集成连续流动式PCR，可以把样品制备、PCR扩增以及产物检测等功能集成在一起以连续流动的方式进行快速、集成化DNA分析。
目前，连续流动式PCR可分为微电子机械系统（MEMS）技术的芯片式和毛细管的非芯片式两种[7]。前者通过微加工技术将微通道加工在硅/玻璃/聚合物衬底材料上，集成化程度高、系统所占空间体积小。然而，尽管聚合物的微加工方法（如压模、注模以及激光刻蚀）比较简单、价格便宜，但是在硅/玻璃上刻蚀微通道通常要真空溅射或蒸发沉积的金属渡膜技术在片基上镀惰性金属作为掩膜，制作困难、技术复杂、步骤多、成本高。还有，在芯片加工而成的“蜿蜒”型[８~１４]或“螺旋”型[１５，１６]通道所构成循环数目通常是不可变的。有时为了获得可变的循环数目，通常采用“环状”通道[１７，１８]、直通道中振荡流[１９，２０]或者其它结构[２１]。
另一种重要的连续流动式PCR是基于毛细管构成的单向型连续流动式PCR[２２~２3]，这种形式的PCR扩增体系构建非常简单，只要把毛细管环绕在PCR扩增所需的３个恒温的温度体系上；PCR扩增的循环数目很容易实现可变化形式；在同一PCR装置中可以采用不同内径的毛细管作为PCR反应体系来满足不同的要求；重要的是，这种非芯片连续流动式PCR的３个温度带总是呈圆（柱）形，DNA样品高温解链后直接流动经过低温区带进行引物退火，再流动经过中温区带进行延伸，这种温度带布置形式可以避免已解链的单链DNA样品经过延伸温度带时可能会与模板链或它们的互补链结合形成双链而降低PCR扩增效率。然而，到目前为止，这种结构形式中的３个恒温体系都是采用热容较大的液体浴[２２]或者金属块[２3]来实现，能量消耗较大，很难将PCR装置采用电池来提供能量以便实现便携式的连续流动式PCR微装置，而且采用液体浴来维持PCR ３个温度带时PCR装置放置的方向性会受到很大限制。本研究将采用３个具有低能量消耗的软性薄膜加热器紧密地贴在一定内径的塑料芯上来构成PCR所需要的３个温度带。采用内径为Φ 0.5 mm的聚四氟乙烯（PTFE）毛细管微通道作为PCR反应体系来构建连续流动式PCR生物微流控系统，通过这种微流控系统来实现一段长度为249 basepair (bp)的β肌动蛋白基因片断的快速扩增。
２ 实验部分
２．１ 仪器与试剂
连续流动式PCR微流控装置示意图如图1所示。 系统主要由交流电供给装置、３个PID温度控制器（日本理化工业株式会社）、调压器、数据采集系统（安捷伦科技有限公司）、软薄膜加热器 （7.5 cm×2.5 cm×0.2 mm，电阻（20±0.5） Ω，北京宏宇航天技术应用公司）和K型热电偶（感温金属丝直径为50 μm , 外绝缘包皮直径为700 μm，Omega）等构成。PCR微流控装置（图1中的虚线框）是由３个薄膜加热器形成的３个温度带以及缠绕在上面的内/外径为0.5 mm/0.9 mm的透明PTFE毛细管（无锡市祥健四氟制品有限公司）构成。连续流动式PCR微流控装置中恒温带a,b或c构成示意图如图2所示。两层薄铜片、薄膜加热器以及塑料绝热片在厚度为0.1 mm的耐高温双面胶（3M）作用下紧凑地连在一起。将３根K型热电偶分别粘附在薄铜片表面测量温度，在3个PID温度控制器的作用下来控制PCR所需要的3个温度即解链温度94℃、退火温度54℃以及延伸温度72℃。
PCR反应的化学试剂中，10 ×Taq缓冲液(200 mmol/L KCl, 200 mmol/L TrisHCl (pH 8.4), １5 mmol/L MgCl2)、热稳定的Taq DNA聚合酶 (5 U/ μL)、高纯度型脱氧核苷三磷酸（dNTPs）(其中dATP、dGTP、dCTP以及 dTTP的浓度均为2.5 mmol/L)以及双重去离子水（ddH2O）（北京天为时代有限公司）；扩增249 bp的人类β肌动蛋白基因片断的引物（上海英骏生物技术有限公司）序列分别为５′AAGGC CAACC GCGAG AAGAT３′(上游引物)和５′TCGGT GAGGA TCTTC ATGAG３′(下游引物)；模板DNA通过DNA快速提取试剂盒BioGeneExpuze TM (TBGTexas BioGene Inc.)从某病人的血液中提取，其浓度通过紫外分光光度计（amersham pharmacia biotech）测量为15 mg/L。
用于毛细管内表面动力学钝化的小牛血清蛋白（BSA）（组分 V，纯度>98％，德国Roche公司）；GoldViewTM荧光染料（北京赛百盛基因技术有限公司）；琼脂糖（西班牙BioWest公司）；5×TBE通过溶解54 g Tris 碱、27.5 g 硼酸以及20 mL 0.5 mol/L乙二胺四乙酸（EDTA） (pH 8.0)于1000 mL的ddH2O中制取；用于琼脂糖凝胶电泳中DNA条带分析的DNA Marker（北京天为时代有限公司）包含2000、1000、750、500、250以及100 bp的6个条带；TS 260精密注射泵（保定兰格恒流泵有限公司）。
２．２ 实验方法
２．２．１ 连续流动式PCR扩增 4.5 m的PTFE毛细管从PCR微流控装置底部开始沿着解链→退火→延伸的顺序被精确地缠绕在PCR ３个温度带上。其中进口处的毛细管长度约为0.5 m，出口处的长度约为0.3 m。毛细管每缠绕一圈即形成一个PCR循环，共缠绕33圈。在每个循环中覆盖在解链、退火以及延伸温度区的毛细管长度即为薄膜微加热器的宽度25 mm，因此在任何流速下，DNA解链、引物退火以及酶促延伸所需的时间比都为1∶1∶1。为了有利于双链DNA的初始解链以及最后的酶促延伸反应，在第一个以及最后一个循环中通过分别位于解链区以及延伸区的薄膜加热器侧翼的“突出物”来使覆盖的毛细管长度都为75 mm。25 μL的PCR混合物从进口处引入毛细管通道后,在精密注射泵驱动下，以注射器中的空气为载流体来实现连续流动式PCR扩增。在毛细管出口处用0.2 mL的聚丙烯试管接取流出的扩增产物，于4℃冷藏待测。在连续流动式PCR扩增反应中，25 μL 的PCR混合物中含有1×PCR缓冲液（20 mmol/L TrisHCl (pH 8.4), 20 mmol/L KCl, 1.5 mmol/L MgCl2）、各0.2 mmol/L 的dNTP、 各0.5 μmol/L 的上下游引物、1.8 mg/L 人类基因组DNA、0.025~0.3 U/μL Taq DNA聚合酶、一定浓度的BSA以及相应体积的ddH2O。
图1 连续流动式聚合酶链式反应微流控装置示意图（略）
Fig.1 Schematic diagram of continuousflow polymerase chain reaction (PCR) microfluidics
图2 连续流动式PCR微流控装置中恒温带构成示意图（略）
Fig.2 Schematic diagram of the thermostable zone based on the flexible thin film heater for the continuousflow PCR microfluidics
2.2.2 传统PCR扩增作为阳性控制 阳性控制的PCR扩增采用相对应的PCR混合物在一台传统PCR仪（iCyler, 美国BioRad公司）上进行，循环程序设定如下：5 min 初始解链，接着33个循环：94℃ 30 s, 54℃ 45 s、72℃ 45 s，最后5 min补齐延伸反应，整个PCR反应所需时间大约为2 h。
2.2.3 PCR产物的检测 取PCR产物8 μL和1.6 μL 6 ×上样液均匀混合，加到2.5 % (m/V)的琼脂糖（含GoldViewTM染料，10 mL的琼脂糖溶液中加6.5 μL GoldViewTM染料）上样孔中，然后在水平电泳槽（美国BioRad公司）中的0.5×TBE缓冲液环境下采用8 V/cm的电场运行大约45 min，最后在GeneGenius凝胶电泳成像仪 （英国Syngene公司）上对PCR产物进行分析。
３ 结果与讨论
３．１ Taq DNA聚合酶的浓度对PCR扩增的影响
不论在传统聚丙稀试管中还是在毛细管微通道中，Taq DNA聚合酶都是PCR反应中一个重要的成分。图3 (A)表明在流速v=2.0 mm／s的情况下连续流动式PCR中Taq DNA聚合酶的浓度对PCR扩增的影响，随着Taq DNA聚合酶浓度的增加PCR产物的数量也增加。然而，尽管Taq DNA聚合酶浓度从低浓度的0.025 U／μL（图3（A）中条带2）增加到较高浓度的0.30 U／μL（图3（A）中条带7），从相对荧光强度的变化判断PCR产物仅增加约2倍，而在传统PCR仪上Taq DNA聚合酶浓度为0.05 U／μL（图3（B）中条带3）就可以得到数量可观的PCR产物，再增加聚合酶浓度PCR产物的数量不仅没有增加，反而可能出现非特异性扩增（图3（B）中条带7）。因此，图3(A)和(B)表明了在微通道中进行连续流动式PCR扩增,由于毛细管微通道比表面积(SVR)为8 mm-1，比传统聚丙烯试管增加了4~5倍，Taq DNA聚合酶容易吸附到毛细管内表面上，不利于PCR的扩增。因此，必须对毛细管微通道内表面进行适当处理以减少由于SVR增大内表面对Taq DNA聚合酶的吸附作用。需要指出的是，PCR混合物中的其他成分如引物、PCR缓冲液、底物dNTP以及模板DNA等也可能会吸附到微通道的内表面上，然后它们的数量在一个PCR反应中通常是足量的，微通道表面对它们少量吸附也许不会影响PCR的成功扩增。
图3 连续流动式PCR微流控装置(A)和传统PCR仪(B)上Taq DNA聚合酶的浓度对PCR扩增的影响（略）
Fig.3 Effects of concentrations of Taq deoxyribonucleic acid (DNA) polymerase on PCR amplification on the continuousflow PCR microfluidics (A) and on the conventional PCR machine (B)
1． DNA 分子量标记 (the DNA markers)； 2~7． 25 μL 的PCR混合物中Taq DNA 聚合酶的浓度依次为（Taq DNA polymerase in a 25 μL PCR mixture）： 0.025, 0.050, 0.100, 0.150, 0.200和 0.300 U/μL ； 8． 阴性控制PCR，在PCR混合物中无DNA模板 (the negative control PCR, no DNA template in the PCR mixture)。
３．２ 毛细管微通道中BSA动力学钝化对PCR扩增的影响
目前，PCR微流控装置中经常采用静力学和动力学表面钝化技术来对微通道内表面进行修饰以减少其对生物分子的吸附作用。前者通常使用PCR“亲和”物质在PCR微流控装置微加工过程中或者真正的PCR化学反应之前对内表面进行预处理以达到表面钝化的目的（包括淀积的硅氧化物和化学硅烷化试剂（如二氯二甲基硅烷（DDMS）[８，１０，１２，２０，２１]）、六甲基二硅氮烷（HMDS）[９]、二甲基甲酰胺（DMF）溶液中的三甲基氯硅烷(TMS)和咪唑[２3]等），然而这种技术时间长、过程复杂，而且硅烷化后的微流控装置也需要保存在液体中以保护硅烷薄膜免于损坏，不利于实际应用。动力学表面钝化技术发生于PCR微流控装置的样品填充和实际运行工作过程中，通过在反应混合物中添加钝化试剂来完成。对于这种钝化技术，经常采用的钝化试剂包括牛血清白蛋白(BSA)[９，１６，2１] 、吐温20 (Tween20) [８～１０，２1]以及聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)[８，１４]等。在本工作中用BSA作为钝化试剂来减少毛细管内表面对试剂的吸附，尤其是对Taq DNA 聚合酶的吸附，以便使PCR扩增能顺利进行。图4 表明了在流速v=2.0 mm／s的情况下，25 μL的PCR混合物中不同浓度的BSA对连续流动式PCR扩增的影响。当不用或者用低质量百分比浓度（图4中条带2和3）的BSA动力学钝化毛细管内表面时，连续流动式PCR扩增效果不佳；当浓度为0.01%（图4中条带4） 的BSA动力学钝化内表面时，扩增效果得到明显改善，PCR产物的数量与传统PCR仪上阳性控制PCR产物数量相当；当浓度进一步增大时，PCR扩增产物的数量几乎不再增加（图4中条带5～7）（在下面的实验中，选取0.025%BSA来对毛细管内表面进行动力学钝化）。一定浓度范围内的BSA之所以能够改善微流控情况下的PCR扩增，是因为一定浓度的BSA能够和Taq蛋白酶竞争吸附到微通道的内表面上，从而减少Taq蛋白酶吸附到内表面上。但是，当BSA浓度达到或超过饱和浓度时，PCR产物的数量不再随着BSA浓度的增加而增加。较高浓度的BSA (>0.4%)动力学钝化毛细管内表面时不但在操作上比较困难，而且可能抑制PCR扩增，这是因为BSA和Taq蛋白酶竞争吸附到内表面的同时也阻止了Taq蛋白酶动力学扩散。
图4 毛细管内表面的牛血清白蛋白动力学钝化对连续流动式聚合酶链式反应扩增的影响（略）
Fig.4 Effect of bovine serum albumin (BSA) dynamic passivation of the capillary inner surface on continuousflow PCR amplification
1． DNA 分子量标记 (the DNA markers)； 2~7． 25 μL 的PCR混合物中BSA的浓度依次为（BSA in the 25 μL PCR mixture）： 0, 0.005, 0.01, 0.025, 0.05, 0.075% (m/V)； 8. 阳性控制PCR，PCR混合物以2.0 mm s-1的速度流过PCR微流体通道(the positive control PCR. the PCR mixture was driven to flow through the PCR microchannel at a flow rate of 2.0 mm/s)。
3.3 PCR混合物在毛细管微通道中的流动速度对PCR扩增的影响
对于连续流动式PCR，一个显著的特点是可以通过改变PCR混合物在微通道中的流动速度来调整PCR的循环速度，如图5A所示。当线性流动速度从1.5 mm/s增大到7.5 mm/s时，PCR产物的数量逐渐减少，然而PCR扩增的循环速度则逐渐增快（即PCR扩增所需要的时间越来越少）,见图5A中条带3和7。线性流速为1.5 mm/s，33个PCR循环所需要的时间约为50 min，线性流速为7.5 mm/s时需10 min。然而，它的极大循环速度则受Taq DNA聚合酶的动力学所控制，也就是受延伸时间所控制，这是因为在72℃时Taq DNA聚合酶的延伸速度为(60~100)核苷酸/秒。对于成功扩增249 bp的人类β肌动蛋白基因片断，延伸时间至少需要5 s (图5A中条带6)，延伸时间少于5s (图5A中条带7)则扩增效果不理想甚至失败。可是，当在传统PCR上采用与连续流动式PCR相对应的延伸时间时(其它条件同阳性控制)，每个条件下PCR产物的数量都与阳性控制PCR相当 (图5B)，导致这种现象的可能原因是传统PCR的加热和冷却速度缓慢，延伸反应不仅发生在程序设定的延伸阶段，而且也发生在程序设定的延伸阶段两侧的升温阶段。在连续流动式PCR微流控装置中，由于３个不同温度区之间的温度转换迅速，延伸反应严格地限制在延伸温度区里，因此PCR产物的数量随着流速的增加（即延伸时间的减少）而减少。
图5 (A) PCR混合物在毛细管微通道中的流动速度对连续流动式PCR扩增的影响；(B)传统PCR仪上不同的延伸时间对PCR扩增的影响（略）
Fig.5 (A) Effect of various flow rates of PCR mixture in the capillary microchannel on continuousflow PCR amplification. (B) Effect of various extension times within the conventional PCR machine on PCR amplification
（A）: 1． DNA分子量标记(DNA markers)； 2． 阳性控制PCR (positivecontrol PCR)； 3~7． 在线性流速分别为1.5, 2.0, 3.5, 5.0 和 7.5 mm/s条件下连续流动式PCR扩增产物(continuousflow PCR products at various linear flow rates, 1.5, 2.0, 3.5, 5.0 and 7.5 mm/s, respectively)； 8． 阴性控制PCR，无DNA模板的PCR混合物以2.0 mm/s的线性速度流动 (negative control PCR, PCR mixture with no DNA template run at a linear flow rate of 2.0 mm/s)； (B): 1c． DNA分子量标记(the DNA markers). 2c． 阳性控制PCR (positivecontrol PCR). 3c～7c． 在延伸时间分别为17s, 13s, 7s, 5s以及3s条件下的PCR扩增产物(PCR products at various extension times, 17 s, 13 s, 7 s, 5 s and 3s, respectively)； 8c． 阴性控制PCR, 延伸时间相同于2c (negative control PCR, the extension time was the same as one in 2c) 。
本实验采用PTFE毛细管的连续流动式PCR微流控装置，通过在PCR混合物中添加一定浓度的BSA有效地抑制了Taq聚合酶由于较高的SVR而引起的表面吸附，成功扩增时的PCR产物的数量与传统PCR仪上的扩增产物的数量相当，其扩增效果优越于单单通过增加Taq聚合酶的数量来增加PCR产物的数量。此外，本PCR微流控装置在15 min甚至10 min之内就能够成功地扩增出249 bp的人类β肌动蛋白基因片断，扩增速度要比传统PCR仪快得多。更值得指出的是，由于目前的PCR微流控装置采用低热容量的薄膜加热器来维持PCR扩增所需要的３个温度区，其能量消耗要比传统PCR的能量消耗低得多。据估算，完成33个循环的连续流动式PCR，能量消耗小于8．8 Wh，有可能改装成便携式装置。
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